单次脉冲暴露条件下直接及延迟超声激活细胞的表征与调控

《Ultrasonics》：Characterization and modulation of directly and delayed ultrasound-activated cells under single-pulse exposure

　　

摘要低强度超声波通过非侵入性、精确的神经元激活展现出治疗前景。推进其临床转化需要明确理解其生物物理机制。然而，由于细胞间通讯的存在，直接超声激活的细胞不可避免地会触发邻近细胞的延迟激活。因此，准确识别这些激活类型对于理解超声-细胞相互作用和提高超声神经调控至关重要。在连续波超声激发下，利用胞内Fluo-4荧光的起始时间和胞内碘化丙啶的变化，准确表征了直接超声激活细胞、延迟激活细胞和超声通透细胞。对于直接超声激活细胞，胞内Ca2+瞬变的激活效率、幅度和达峰时间与声压呈正相关，但与脉冲持续时间无关，表明声辐射力可能在细胞激活中发挥关键作用。较长的脉冲间隔增加了重复细胞激活的概率，其中约5分钟的间隔显著增强了超声脉冲与细胞激活之间的时间耦合。Gd3+和2-APB处理降低了激活效率和胞内Ca2+反应水平，表明TRP家族离子通道参与直接激活。对于延迟激活细胞，细胞间Ca2+波的传播速度与直接超声激活细胞的比例和程度近似线性增加，但随着这些细胞中胞内Ca2+瞬变达峰时间的延长而降低，表明延迟激活源自直接超声激活细胞。Gd3+、2-APB和BAPTA处理后延迟激活细胞的传播速度降低，表明间隙连接依赖性通路和ATP介导的旁分泌信号参与细胞间Ca2+传播。这些信息有助于区分直接超声激活细胞和延迟激活细胞，从而推进对每种激活类型机制的理解。引言低强度聚焦超声波作为一种新兴的神经调控技术，展现出巨大潜力，它能够非侵入性地穿透颅骨和软组织，以毫米级空间精度调节深部脑区的神经活动，同时具备安全性高、便携且成本低廉的特点[1]，[2]，[3]。近期在小动物、非人类灵长类动物和人类中的研究表明，经颅聚焦超声波通过靶向调控神经元活动，可有效改善神经退行性病变、缓解慢性疼痛、调节血压、调控骨关节炎软骨细胞以及刺激胰岛素分泌，展现了该技术的临床价值[4]，[5]，[6]，[7]，[8]。然而，超声神经调控的进一步临床转化需要全面理解其基础生物物理机制。近年来，在阐明超声神经调控机制方面已取得显著进展[9]，[10]。由于超声激活的细胞反应源于声波与组织的相互作用，已有大量研究探讨声学条件（例如脉冲序列（连续波或脉冲波）、激发频率、脉冲持续时间（PD）、声压（AP）、声强（AI）、脉冲重复频率（PRF））和生物学因素（例如细胞类型、机械敏感性通道表达）如何影响超声介导的细胞激活[2]，[11]，[12]，[13]，[14]。通常使用连续波（单一脉冲，持续时间从亚毫秒级到500毫秒）或脉冲波（多个脉冲，持续时间在微秒级，PRF在千赫兹范围）序列来激活细胞反应[11]，[15]，[16]，[17]，[18]。与脉冲波序列相比，连续波照射导致更高比例的激活细胞、更快的反应（对超声激发的反应起始延迟降低）以及相同的反应持续时间（达到胞内钙变化半最大值的最大时间）[19]，[20]。然而，一些研究表明脉冲波超声所需的功率低于连续波超声即可实现相当程度的神经激活[21]，[22]。在固定脉冲序列下，更高的AP或AI、更长的PD和更高的PRF通常与更强的细胞反应相关（即激活细胞比例增加以及达到胞内钙变化半最大值的最大时间延长）[16]，[23]，[24]。随着超声频率增加，需要更高的强度才能实现相似的细胞反应。较低基频观察到更高的超声激活幅度[24]，[25]。此外，越来越多的证据表明，神经调控中应用的声功率相对较低，相关热效应微小或可忽略（温升<0.1°C），机械效应成为超声神经调控的潜在主要驱动因素[22]，[26]，[27]。声辐射力（ARF）和压力引起的体积压缩被认为在细胞激活中发挥关键作用[28]，[29]，[30]，[31]，[32]。此外，这种机械效应可能通过机械响应成分在生物学水平上表现出来，包括质膜和细胞骨架中的机械敏感性离子通道（例如TRPA1[11]，[15]，[33]；TRPV1[19]，TRPC6[33]，TRPC1[34]，Piezo1[35]，TRAAK[36]，TRPV1[19]，MSCL[37]），这些通道能够感知机械力（例如声辐射力）并启动细胞信号传导，从而决定超声激活细胞反应的概率和幅度。此外，这些离子通道的激活导致Ca2+逐渐积累，并通过Ca2+-和电压门控Ca2+及钠通道放大，产生显著的胞内Ca2+瞬变（即更强的细胞激活）[16]，[17]。此外，研究发现肌动蛋白细胞骨架发生解聚，导致诱导的Ca2+反应幅度显著降低[11]。这一发现表明机械力转导深度参与超声介导的细胞激活[11]，[16]，[20]。上述发现为理解超声激活细胞反应的生物物理和分子机制提供了基本框架。然而，在不同实验模型中使用的多样声学条件下，已产生不一致甚至矛盾的结果[14]，[19]，[22]，[24]，[38]。这些差异不仅源于细胞固有敏感性的差异，更重要的是缺乏针对不同声学参数组合与优化的基础理论。因此，确定超声诱导细胞激活的决定因素并建立标准化方法以确保实验可重复性至关重要。首先，对于给定的脉冲序列，大多数研究关注胞内Ca2+瞬变（通常用作细胞激活指标）是否在整个超声刺激持续时间内发生，而非在每个单独脉冲期间发生[15]，[17]，[39]，[40]。因此，难以确立每个声学脉冲与胞内Ca2+瞬变之间的时间对应关系。这反过来使得难以使用脉冲波实现对激活细胞反应的光遗传学式精确时域控制，即每个光脉冲激活相应的细胞反应。此外，连续脉冲之间需要最小的时间间隔以避免重复刺激间的干扰并产生细胞激活[15]，[17]，[39]，[40]。因此，对应于较短间隔的高PRF脉冲波使建立每个脉冲与细胞激活之间的直接时间联系更具挑战性。与脉冲波相比，在可忽略的热效应下，连续波超声为实现声学刺激与细胞反应之间的直接时间关系提供了潜力。因此，连续波刺激似乎更适合细胞激活研究。其次，大多数先前的研究通过（实时）追踪遗传编码的Ca2+指示剂（GCaMP6，jGCaMP7）或胞内Ca2+指示剂（Fluo-4 AM，Fura-2 AM）的相对变化来确定细胞能否被超声激活[11]，[15]，[16]，[17]。大多数关于超声激活细胞反应的研究认为，当胞内Ca2+指示剂的荧光变化超过基线值的10%–30%时，细胞即被激活。这一标准似乎正确。然而，细胞膜的通透性可能被超声照射增强，导致胞内Ca2+瞬变[41]，[42]，[43]，[44]。此外，通过细胞间通讯，超声激活或通透细胞的胞内Ca2+瞬变也可传播到邻近细胞，形成延迟的细胞间Ca2+波信号[43]，[45]，[46]。近期报告显示，这些延迟的Ca2+波信号在超声照射后数秒至数分钟发生[7]，[47]，[48]。这两类胞内Ca2+瞬变分别源自通透的膜和生物组织内生化信号传递，而非超声与组织本身的相互作用。然而，大多数研究并未明确区分直接超声照射、膜通透性增强和细胞间通讯引起的胞内Ca2+瞬变。这导致直接超声激活细胞反应的决定因素存在不确定性，混淆了对直接超声激活细胞主要生物物理机制的解释，并阻碍了提高超声神经调控效率策略的设计。本研究旨在开发一套系统化、标准化的研究框架，以可靠地阐明声学和细胞因素如何影响超声介导的细胞激活效率。在非热连续波激发下，我们表征了三种超声影响的细胞反应类型：直接超声激活细胞、延迟激活细胞和超声通透细胞。我们通过改变AP、PL和脉冲间隔来评估对直接超声激活细胞的主要物理效应。进一步分析了细胞间Ca2+波的传播速度以及影响延迟激活细胞的因素。最后，使用不同抑制剂研究直接超声激活细胞和延迟激活细胞的潜在机制。细胞培养人胚胎肾293 T细胞购自国家 authenticate 细胞库，使用含10%胎牛血清（Gibco, 10099, Invitrogen, USA）的Dulbecco改良 Eagle 培养基（DMEM）（Hyclone, SH30285.FS, Thermo Fisher Scientific, USA）在5% CO2和37°C条件下培养。当细胞达到约70%汇合度时，将细胞接种至定制培养皿（直径35毫米）——适用于共聚焦显微成像，底部厚度为2毫米，小于工作距离的。直接超声激活、延迟激活和超声通透细胞的表征我们首先提供一个代表性样本以说明直接和间接超声激活的细胞反应，如图2A1–A2所示。在单次脉冲声学发射前，目标区域未观察到胞内Fluo-4荧光（0秒）。在发射单次声脉冲（PNP为0.30 MPa，PD为100毫秒）后，目标区域内一些细胞在2–15秒内迅速出现明亮的胞内Fluo-4荧光，并快速达到峰值强度，峰值在。直接超声激活细胞的总结在固定PNP和PD的单次连续波超声脉冲照射下，根据照射后胞内PI变化和胞内Fluo-4荧光变化的起始时间，将超声诱导的细胞反应分为三类：直接激活细胞、延迟激活细胞和超声通透细胞。超声诱导的细胞通透现象（已知为声孔形成）主要用于药物递送应用，超出。结论通过分析照射后胞内Fluo-4荧光的起始时间和胞内PI摄取的变化，我们确定了三种不同的细胞反应类型：直接超声激活细胞、延迟激活细胞和超声通透细胞。区分这些反应可避免超声诱导的细胞反应混淆，并允许更清晰地解析直接超声激活细胞的生物物理机制。比例CRediT作者贡献声明Yuhang Ma：方法学、调查、形式分析、数据整理。Jianpeng Wei：软件、方法学。Alfred C.H. Yu：资源、方法学。Peng Qin：写作—审查与编辑、写作—原稿、监督、资源、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。利益冲突声明作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在利益冲突：[Peng Qin报告获得中国国家自然科学基金提供财务支持。如有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。]致谢本研究由国家自然科学基金（编号：12320101002和12074255）和上海交大学医工交叉基金计划（编号：YG2019ZDA27）资助。Yuhang Ma|Jianpeng Wei|Alfred C.H. Yu|Peng Qin上海交通大学自动化与智能感知学院，上海 200240，中国