EGG CUP TEST：用于超快处理与测试的增强型生长几何腔室

《Sensors and Actuators B: Chemical》：EGG CUP TEST: Enhanced Growth Geometry Chamber for Ultrafast Processing & Testing

　　

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  在连续灌注条件下，实时、无标记地追踪群体水平酵母生长动力学
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  量化的、剂量依赖性的乙醇生长抑制动力学，并传播测量误差
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  通过FMold工艺在阵列尺度上制造的、可重复的、均匀深度的多级凹形微孔
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  基于几何形状和流动模拟指导的设计，用于在连续流动下保留悬浮细胞

引言

细胞培养是现代研究、临床和制药应用中不可或缺的工具[1]，为研究细胞行为、刺激反应和药物疗效提供了基础。非贴壁细胞培养的传统方法包括从台式生物反应器到摇瓶不等。生物反应器虽然能够产生信息丰富且可靠的数据，但其高昂的成本、耗时的设置和操作流程限制了可同时进行实验的数量。相反，微型生物反应器，如摇瓶，则提供了更低的成本和更短的时间、高并行性以及操作简便性。然而，这些系统往往缺乏精确控制某些实验条件所需的精确度，从而限制了其在特定应用中的效用。[2]

为应对这些局限性，微流控和芯片实验室（LoC）技术作为多功能且强大的替代方案应运而生。[3] 这些平台具有众多优势，包括减少样品和试剂消耗、精确的浓度轮廓以及在单一设备中集成多种功能。[4] 关键的是，它们能够对温度、pH值、流速和剪切应力等关键工艺参数进行精细控制。此外，微流控器件可以进行并行化，在一次性生物反应器中创建可控的长期培养，在保持实验严谨性的同时最小化资源消耗。[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12] 这些系统的关键优势之一是其能够通过持续补充培养基和营养物，同时并发地移除废物和生长抑制性代谢物，来维持稳定恒定的环境。

微流控生物反应器已显示出显著效用；然而，大多数现有系统主要设计用于贴壁细胞培养[8]、[13]、[14]、[15]。相比之下，非贴壁细胞的培养，特别是在灌注条件下，却相对较少被探索。为支持连续流动培养基并防止非贴壁细胞被冲走，几种流体动力学细胞捕获策略通过引入物理约束而在微流控技术中被开发出来。沿主通道设置的侧室[16]、微孔阵列上的微结构陷阱位点[17]以及微柱屏障[18]、[19]等结构均为此目的而被报道。此外，一种近期策略是将腔室底部制成凹形以促进细胞捕获和聚集[20]、[21]，然而，所用方法导致孔洞过深，或者无法在整个微孔阵列中实现均匀深度。

此外，监测微流控器件中的细胞生长对于组织工程、药物筛选和诊断等应用至关重要。为支持这些功能，已开发了多种集成传感方法来追踪细胞增殖。几种非光学方法已被证明在监测微流控系统细胞生长方面有效。电抗谱学（EIS）通过测量细胞在电极上增殖时的电性能变化，实现了对细胞粘附和屏障完整性的无标记实时监测。[22] 电化学生物传感器可高灵敏地检测葡萄糖、乳酸或细胞因子等代谢指标。[23] 然而，这些技术可能需要频繁校准，且可能受到培养基复杂性的影响。基于质量的传感器，如石英晶体微天平（QCM）和微悬臂梁平台，可检测质量或机械应力的变化，尽管它们通常仅限于2D培养且通量较低。[24] 新兴的光谱方法，如拉曼和红外（IR）光谱，提供了无标记、非侵入性的细胞化学分析，能够检测分子成分和代谢变化。[25] 这些技术提供了丰富的生化信息，但常常受到高成本、复杂数据解读以及对噪声敏感性的阻碍。光学方法经常被集成到微流控系统中，仍然是最常用的细胞生长监测工具。明场、相差和荧光显微镜技术允许直接实时观察细胞形态、增殖和迁移。其他光学技术，包括吸光度和散射光测量，提供了无标记的细胞密度和代谢活性定量。尽管具有多功能性和高分辨率，光学方法可能笨重、昂贵且计算量大，尤其是当应用于长期或高通量实验时。尽管如此，它们仍然是微流控平台中不可或缺的工具，因为它们能够以空间和时间的分辨力提供对细胞行为的洞察。

在此背景下，在微流控系统中评估毒性面临着独特挑战，尤其是与非贴壁细胞工作时。与贴壁细胞不同，这些细胞群体不锚定在基底上，使得空间追踪和一致的纵向测量更加复杂。在连续流动条件下，非贴壁细胞容易因剪切诱导的冲走、不均匀沉降或聚集而丢失，这可能导致微通道内细胞分布不均匀。此外，与通道壁的相互作用、剪切应力梯度或气泡捕获可能引入机械应力，从而可能混淆化合物诱导的细胞毒性效应的解释。应对这些挑战需要仔细优化器件几何形状、精确控制流速，并实施能够区分真实毒性效应与微流控平台本身产生的伪影的实时成像或基于阻抗的检测策略。

为应对与非贴壁细胞培养、快速生长监测和化合物毒性评估相关的挑战，在本研究中我们开发了增强型生长几何腔室，用于超快处理与测试，称为EGG CUP TEST（EC-Test）。该平台由一个多级微流控器件组成，具有凹形、蛋杯状腔室，专门设计用于支持悬浮细胞的生长。通过对每个腔室中培养物占据区域进行实时成像，能够以单个成像/脉冲间隔的时间尺度检测到生长速率的变化。作为概念验证，该系统被用于评估乙醇对酵母培养生长速率的影响。

EC-Test的新颖之处在于整合了三个互补特征：(i) 通过简单的顶部光学成像，而非单细胞追踪或终点测量，连续无标记监测非贴壁细胞的整个群体生长动力学；(ii) 使用FMold工艺[26]可重复地制造深层、均匀深度的凹形微孔阵列，实现在灌注下稳定的长期细胞限制；以及(iii) 一种由计算流模拟支持几何指导的器件设计，以更好地了解微孔内的流体动力学条件。

章节片段

微流控器件设计与制造

该多级微流控器件使用我们团队先前开发的方法制造[26]、[27]、[28]。与依赖SU-8等光刻胶的传统制造方法不同，我们的方法采用FMold技术，其中洁净室光刻主版被柔性主版取代，通过将CAD设计的图案转印到柔版印刷板上获得该柔性主版[26]、[27]、[29]。简要而言，我们使用CAD软件设计了微流控腔室和天花板，

微流控器件表征

为了确定酵母生长的最佳条件以及后续分析，三种井尺寸（700、1200和2100 μm）被设计并整合到单个微流控芯片中（图4A）。这种配置允许在相同环境条件下直接比较不同空间限制下的生长动力学。通过改变孔尺寸，我们能够评估限制如何影响细胞增殖和聚集体形成。从该获得的结果

结论

在本工作中，我们设计并制造了EGG CUP TEST（EC-Test），一种具有不同尺寸孔洞的微流控器件，专为酵母细胞连续培养中的生长分析而开发。使用活细胞成像来监测和估算每个尺寸孔中细胞随时间的生长情况，并通过浓度依赖性乙醇毒性实验验证了该平台。该器件允许精确观察和分析，增强了对

CRediT作者贡献声明

Mollera Marta：监督、概念化。Juan Ignacio Perez Lerner：方法学。Ramiro Isa Jara：软件、方法学。Natalia Bourguignon：验证、方法学、调查、形式分析、数据整理。Gimenez Rocio：写作 – 审阅与编辑、写作 – 原稿、可视化、验证、监督、资源、方法学、调查、形式分析、数据整理。Juan Fernando Campa?a-Perez：写作 – 原稿、可视化、方法学、调查，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了阿根廷国家科学和技术研究委员会（CONICET）、国家研究促进与技术发展创新署（PICT 2021-00167）、PID UTN TC 59、PID UTN TCI58和FITBA 2024 195 A的资助。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

Juan Fernando Campa?a Perez 毕业于厄瓜多尔武装部队大学（ESPE）生物工程学专业。他目前正在阿根廷国家技术大学攻读工程学博士学位。他的研究兴趣包括微流控、生物技术、生物材料和生物过程工程。

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