基于核酸外切酶Ⅰ扩增的机器学习优化二价适体传感器用于痕量膝纹酸检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A machine learning-optimized bivalent aptasensor based on exonuclease Ⅰ amplification for trace okadaic acid detection

　　

本位适体与外切核酸酶Ⅰ（Exo Ⅰ）扩增实现了对水产品中毒蛙碱（OA）痕量检测。
机器学习实现了对复杂水产品基质中OA的准确定量。
该适体传感器检测限（LOD）为16.18 pM，具有优异的特异性。
基于主成分分析（PCA）的回归分析R2为0.9906，k近邻（KNN）算法准确率达100%。
简单两步流程，在五种加标水产品样品中表现出稳健性能。

引言

毒蛙酸（OA）是由海洋藻类或微生物产生的一种脂溶性次级代谢产物，是腹泻性贝类毒素（DSPs）的主要成分。人体摄入被OA污染的双壳类贝类后可导致胃肠不适、恶心、呕吐、腹泻、腹痛及发热。近期研究发现，OA可通过LO2细胞中的细胞周期阻滞和凋亡机制诱导肝毒性效应[1]。OA作为多种器官中有效的肿瘤启动因子，具有细胞毒性、慢性毒性和遗传毒性。鉴于上述危害，全球范围内均对OA的最大残留限量实施了严格规定。例如，欧盟（EU）规定贝类肉中OA的最大允许限量为160 μg/kg [2]。

迄今为止，已开发出多种OA检测方法，但这些方法在实际应用中面临显著瓶颈：高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）依赖昂贵仪器和专业操作人员[3]，不便现场检测。酶联免疫吸附测定（ELISA）成本较低，但抗体在温度和pH波动下不稳定，且假阳性率超过10% [4]。小鼠生物测定法因伦理问题在欧盟等地区已被禁止使用，且灵敏度较低[5]。因此，亟需开发新的OA快速分析方法。适体传感器作为理想替代方案，克服了现有技术的多数局限[6]。开发稳定、高灵敏度且成本效益高的探针是适体传感器构建的基础[7]。

近年来，适体在食品安全分析中的应用大幅增长，尤其是用于重金属、食源病原微生物、抗生素和多种生物毒素的检测[8], [9]。适体是通过指数富集配体系统进化（SELEX）技术获得的RNA或单链DNA（ssDNA）分子，具有一系列有利特性：高结合亲和力、灵活的化学修饰能力和热稳定性[10], [11]。适体与先进信号转导技术的结合，使其可用于贝类毒素的生物亲和性传感检测，实现对这些危险物质的简单快速监测[12], [13]。

尽管适体对多种靶标表现出良好的亲和力，但在进一步提高结合效率和信号转导以实现超灵敏检测方面仍面临挑战，尤其是对于OA等痕量污染物[14]。因此，调节适体-靶标结合和放大识别信号的策略对于提高传感器性能至关重要[15]。与单价适体相比，多价适体探针具有多个结合位点，对靶标分子表现出更高的亲和力[16]。在不同位点的迭代结合可放大识别效应，显著增强适体探针的响应和灵敏度[17]。近年来，双价适体在生物传感研究中日益重要，通过双位点协同结合靶标分子，显著提高检测灵敏度和特异性[18]。基于双价适体的生物传感器可通过开发便携式检测设备用于水产品中OA的现场检测，从而推进水产品安全监管，提高海关和市场监管机构的风险防范与控制效率[19]。

在适体传感器开发过程中，新型纳米探针通常可使检测系统更加灵敏和紧凑[20]。近年来，研究人员开发了多种新型荧光探针用于构建基于双价适体的荧光生物传感器[21]。其中，DNA-银纳米团簇（DNA-AgNCs）是一种利用DNA模板合成的新兴荧光纳米探针。与传统有机染料和量子点相比，DNA-AgNCs具有高量子产率、强光稳定性、制备成本低廉和合成方法简单等优势[22]。此外，DNA-AgNCs毒性低且不会发生荧光闪烁[23]。利用这些特性，DNA-AgNCs已被应用于构建多种用于检测抗生素、重金属离子和生物毒素的生物传感器[24]。将双价适体制备为DNA-AgNCs，从而实现荧光双价适体传感器的构建，可扩展适体和DNA-AgNCs的应用范围[25]。

为增强适体传感器的灵敏度，通常需要引入信号放大策略。其中，外切核酸酶Ⅰ（Exo Ⅰ）辅助的靶标循环策略尤为引人注目。Exo Ⅰ选择性地从3'-羟基末端消化ssDNA，但不切割双链DNA或适体-靶标复合物[26], [27]。通过精心设计识别探针，靶标可被释放并多次循环使用，从而显著放大荧光信号，而无需热循环或复杂的酶网络。此外，为增强在复杂基质中的检测鲁棒性，机器学习（ML）已成为一种强大的分析工具[28], [29], [30]。与传统单参数分析不同，ML算法（尤其是随机森林回归（RFR）模型）可处理高维荧光数据以提取细微模式，有效区分真实信号与背景噪声及非特异性干扰[31], [32]。近期研究表明，ML辅助的传感平台可显著提高复杂样品基质中的分析准确性、可靠性和抗干扰能力。ML与生物传感的集成在智能化、精确化、抗干扰的定量分析方面展现出巨大潜力。

本研究通过整合四种协同特性，设计并构建了用于OA检测的双价适体传感器。首先，采用双价适体（B-Apt）作为识别元件，通过双位点结合实现增强的亲和力和选择性。其次，采用Exo Ⅰ辅助的靶标循环扩增策略以增加信号输出，实现高效靶标循环而无需热循环或复杂的酶网络。第三，使用DNA-AgNCs作为荧光探针，利用其高量子产率、强光稳定性和低成本合成的优势。第四，引入机器学习（ML）流程进行多维荧光光谱分析，旨在校正基质引起的波动，并在复杂水产品基质中实现OA的准确定量和分类。

尽管双价适体、DNA-AgNCs、Exo Ⅰ扩增和机器学习已在生物传感领域分别进行了探索，但尚未有报告将这些技术整合到单一适体传感器中用于OA检测。本研究旨在通过结合这四种要素填补这一空白，其中各组分预计发挥不同的作用：B-Apt增强分子识别，Exo Ⅰ策略实现高效信号扩增，DNA-AgNCs提供稳定且灵敏的荧光读数，ML流程解决复杂水产品样品中的基质干扰问题。这种集成设计预计将提供超越各单一组分的协同优势，可能提高灵敏度、选择性和基质耐受性。

该传感器旨在为水产品中痕量OA监测提供一个便捷、灵敏且稳健的平台，并预期可拓展到更广泛的食品安全应用中。

B-Apt亲和力与特异性评估片段

通过荧光淬灭法测定解离常数（Kd），表征了B-Apt的亲和力和特异性[33]。单价适体（Apt）和B-Apt的设计与构建如第3.2节和表S1所述。所有测量均进行三次重复（n = 3），数据以均值±标准差表示。

亲和力测试中，分别取45 μL不同浓度（100 nM、300 nM、500 nM、1 μM、1.5 μM和2 μM）的ssDNA（Apt或B-Apt）各…

OA双价适体传感器的检测机制

开发了一种用于检测水产品中OA的双价适体传感器（图1），其检测机制整合了三个连续阶段：靶标识别、Exo Ⅰ扩增信号转导以及基于机器学习的智能定量。

在识别阶段（图1A），B-Apt与其互补的cDNA杂交形成双链复合物（cDNA-B-Apt-cDNA）。引入OA后，B-Apt特异性结合OA，诱导cDNA链从…

结论

综上所述，成功构建了一种便捷且高灵敏度的双价适体传感器，用于水产品中OA的荧光检测。该系统整合了Exo Ⅰ辅助的靶标循环扩增策略，采用B-Apt作为识别元件，以cDNA-B-Apt-cDNA-AgNCs作为荧光信号探针。

该适体传感器的几个显著特点使其在实用应用中颇具吸引力。双价构型由两个单价OA结合序列连接而成，…

CRediT作者贡献声明

颜欣欣：撰写——初稿，可视化，软件，概念化。
王晶：撰写——初稿，调查研究，概念化。
元腾鑫：软件，调查研究，数据整理。
罗雅萌：资源，数据整理。
方文远：方法论，形式分析。
王小帆：软件，数据整理。
王亚晨：方法论，数据整理。
王军环：资源，形式分析。
吴绍杰：验证，资源。
王维霞：验证，资源。
李富侯：
生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的声明

ChatGPT（GPT-4o，OpenAI）仅用于本手稿的英语语言修订。未使用任何AI工具参与研究设计、数据处理、图表绘制或结果分析。所有图表均由作者手动绘制，所有科学内容均由作者独立生成和验证。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文所报告的工作。

致谢

本研究获得中国博士后科学基金（2023M731397）、江苏海洋大学研究生实践创新计划（KYCX2025-67）、连云港市博士后科研资助计划（LYG20230015）和江苏海洋大学自然科学基金（KQ23020）的资助。

颜欣欣现为江苏海洋大学海洋食品与生物工程学院硕士研究生。她的研究兴趣主要集中在与机器学习相结合的生物传感器在水产品中海洋毒素检测方面的应用。

颜欣欣 | 王晶 | 元腾鑫 | 罗雅萌 | 方文远 | 王小帆 | 王亚晨 | 王军环 | 吴绍杰 | 王维霞 | 李富侯 | 黄强 | 陈金日