通过高通量旋转单细胞光学生物传感表征糖萼与剪切应力的相互作用

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Profiling the glycocalyx-shear stress interplay via high-throughput rotational single-cell optical biosensing

•一种新型旋转流体系统实现了单细胞黏附变化的光学检测。
•波长偏移分析揭示了六种独特的细胞反应模式。
•糖萼的部分酶消化可促进更强的细胞黏附。
•通过顺序旋转和酶处理鉴定出机械抗性细胞簇。
引言
为理解关键的生物过程——包括生理性和病理性过程，如血管疾病、器官发育或免疫反应——必须对细胞的机械环境进行建模。细胞黏附是一种关键的生物过程，细胞通过多种受体-配体相互作用彼此结合或附着于基底上[1][2][3]。在此基本变化过程中，受影响的细胞会发生显著的形态学改变[4]。参与黏附过程的不同蛋白质、受体和配体取决于黏附类型为细胞-细胞黏附还是细胞-细胞外基质黏附，因为它们通过不同的细胞机制生成。当细胞附着于另一细胞时，其未必会变平；相反，它维持更圆的外形，这是黏附力（将细胞向外拉）与内部收缩力（试图将细胞向内拉）平衡的结果[5]。细胞的形状由这些力的动态重塑所决定。然而，当细胞附着于细胞外基质时，通常会变平并向水平方向扩展，因为整合素及其他黏着斑将细胞骨架牢固地固定于基底上[6]。细胞的铺展提供了更稳定的与细胞外基质的机械连接。这一扩展接触区域不仅稳定了细胞，还增加了细胞对剪切力的抵抗能力，而剪切力在生理性体内条件下常遇到。剪切应力是一种机械力，当流体沿表面移动时产生，对单位面积施加切向力。在人体心血管系统中，这一机械力主要由血流作用于构成血管的内皮细胞而产生。剪切应力τ的动态值（dyne/cm2）一般由血液的动态黏度η和靠近血管壁的流速梯度du/dy决定，如公式1所示：
τ = η · du/dy
其中η为血液的动态黏度（dyne·s/cm2），du/dy为垂直于血管壁方向的速度变化率，通常以1/s表示。
然而，值得注意的是，剪切力不仅取决于血流速度和血液动态黏度，还取决于血管壁的弹性和光滑度[7]。这在生物系统中尤为相关，因为构成血管内壁的内皮细胞腔面覆盖着一层富含碳水化合物的基质，称为内皮糖萼层（EGL）[8]。糖萼是厚度在0.5至4微米之间的复杂碳水化合物层，存在于包括内皮细胞在内的多种细胞表面，同时也存在于血管系统、呼吸道管道以及某些白细胞亚群中[9]。它在抗原呈递中发挥关键作用，促进细胞间通讯、机械防护和免疫保护。它促进所谓的白细胞滚动黏附到血管壁上；在肿瘤病变中，较厚的糖萼有助于保护癌细胞免受免疫反应[10]。在神经系统中，它出现于神经元之间的突触连接处，并增强细胞间通讯。相反，其功能障碍可与神经系统疾病以及阿尔茨海默病相关[11]。糖萼的酶促水解可以更好地模拟某些病理状况[12]。EGL由多种带负电荷的糖类组成，如硫酸化糖胺聚糖（例如硫酸肝素）和唾液酸糖蛋白[13]。它不仅对内皮屏障功能至关重要，还作为一种机械转导器，传递诱导细胞形态变化的信号[14][15]。由于糖胺聚糖因硫酸基团和羧基而带负电、高度极化，表现出秩序化水行为，吸引水分子并在其周围促进形成有序的水结构[16]。这一有序水相有助于糖萼在生理条件下为内皮细胞提供保护、减少剪切应力并促进血液在血管中的流动。
为在体外研究生理和病理状况，细胞培养是广泛使用且不可或缺的工具。现代生物学和医学中，通过选择合适的实验方法和细胞、组织类型，我们可以获得令人满意且具有成本效益的替代动物实验的方法，但并非替代品。关于流体流动，有静态和动态两种细胞培养模型，其区别主要在于营养物质、氧气的输送以及作用于细胞培养物的机械力[17][18]。虽然静态模型是监测细胞相互作用、微生物致病性、药物效果或病理机制，以及进行药理学、生理学或病理学研究的多功能工具，但其主要缺点是由于缺乏流体流动，系统内不存在的剪切应力无法充分模拟影响细胞自然环境的生物力学效应[19]。剪切应力的缺失会改变细胞形态、黏附、信号传导和基因表达，而这些在免疫学、肿瘤学和血管研究中尤为重要[20][21]。
因此，提供流体流动和剪切力的动态系统可能提供更准确且具有生理相关性的结果。过去十年中，动态细胞培养技术逐渐占据重要地位，具有根本性优势，但需要比静态模型更长时间和更谨慎的现场试验[22]。为帮助理解生理状况，已有多种体外模型可用。其中一种模型是在流场中培养细胞，从而能够模拟不同的流动模式（层流、湍流、振荡流）[23]。在体外实验中，研究对象的细胞预处理通常在暴露于1至20 dynes/cm2的剪切应力后进行[24]。
最简单的模型之一是平行板流动槽，细胞在PDMS表面生长，使用泵在培养腔中产生特定流速和剪切应力[25]。该方法提供均匀流场，但无法模拟血管的三维几何结构和血管壁的搏动性。另一个显而易见的解决方案是基于产生振荡、倾斜流体流动原理的系统或锥板式系统，其相对容易实现，但用户无法充分控制参数，且主要仅提供终点测量[26][27]。锥板式流动槽利用在静止空间内旋转的锥体以维持均匀流动，从而对细胞产生一致的剪切应力，提供对生理状况的更准确近似。然而，该结构使得在系统内对细胞进行显微观察变得复杂。该领域最先进的技术是所谓的“芯片实验室”微流控装置，其能精确控制微通道内的流速，并具有实时捕捉细胞动态反应的能力。然而，该装置极优越之处也有一个主要缺点：系统本身的复杂性[28]。这些通道能够高精度地模拟血管壁的三维结构，允许研究单个细胞相互作用。然而，剪切力的精确控制仍具有挑战性。
为解决这些局限，我们尝试结合此前方法的优势并尽可能减少缺点，开发了一个定制的商业免标记生物传感器系统，其中孔内流体旋转可实现剪切应力的精确施加。该系统提供高空间和时间分辨率，以及通过消逝波检测实现实时成像，用于检查流动条件下的细胞行为，同时允许使用传统光学显微镜对细胞形态和位置进行验证[29][30]。此外，近年来，提高各种细胞动力学研究分辨率以观察单细胞动力学的重要性日益凸显[31][32]。这种范式转变——将研究从群体水平的细胞研究转向单细胞水平信号分析——只能借助合适的工具实现。技术进步和新方法的应用使细胞能够单独分析而非作为群体分析，从而更详细精确地揭示生物系统的复杂性[33]。生物传感器以极高的空间分辨率，能够在显微镜水平下实时测量细胞，在该过程中发挥着关键作用[34]。值得注意的是，转向单细胞分辨率并不排除继续开展群体水平研究。通过对单细胞数据进行平均和汇总，可以恢复传统群体分析，从而提供在不同层级研究中构建一致且详细图景的机会[35]。因此，这一发展是对群体水平研究的补充而非取代，允许精确的单细胞分析并广泛使用这些研究的汇总数据。
单细胞水平生物物理参数动态变化的研究通常需要高空间和时间分辨率的生物传感器[36]。光学生物传感器提供一个光场，其中发生的过程根据光现象（如衍射、折射、干涉）进行研究[37]。感知基于光场与生物识别组分之间的相互作用。免标记技术不使用任何其他信号放大分子，分析物可以以其完整形式进行处理[38]。光学生物传感器，例如共振波导光栅生物传感器，基于消逝场中的分析组分发挥作用，这些分析组分会在传感器表面的局部区域引起折射率变化，从而改变共振并将入射光转换为光栅波导层中具有不同共振频率的不同波长分量[39]。这种现象称为近表面动态质量重分布。随后，该共振波长分量在波导层内传播一小段时间后通过反射逸出，并被互补金属氧化物半导体相机检测。
本研究使用了康宁EPIC Cardio高空间——单细胞水平分辨率——共振波导光栅生物传感器，该传感器在2 mm×2 mm传感器表面上提供25 μm的横向空间分辨率，能够高度详细地提供细胞相互作用和黏附动力学数据[40]。EPIC Cardio生物传感器是基于共振波导光栅技术的工具，可实现细胞实时免标记监测。其工作原理基于消逝场现象，其中到达传感器表面的光在特定波长下共振，产生仅从边界延伸极短距离的消逝波[41]。该波振幅迅速衰减且不传输能量，但对传感器表面150 nm范围内的折射率变化极为敏感，因此非常适合非侵入性检测分子相互作用和细胞过程[42]。
下表（表1）对比了用于实验室和研究的各种流体系统的关键参数，以及产生本研究结果的光学生物传感器流体系统。
填充人体独特流体空间的液体，以及心血管和淋巴系统，在身体不同区域表现出不同的流动特征。流体空间的流速和对各隔室施加的机械力，如剪切力和冲击力，均受所运输流体中固体和溶解组分的影响[43]。黏附相互作用已被证明在某些疾病的发展和身体健康中发挥作用。例如，癌细胞沿血管壁沉积所导致的固有结构改变，或间隙空间中单细胞的吞噬激活都证明了这一点[44]。当吞噬细胞和部分淋巴细胞退出血管时，特定黏附分子、整合素、钙黏蛋白、选择素以及构成血管壁的内皮细胞上受体之间的相互作用有助于它们通过血管壁进入间质[45]。

已有假说认为，特定黏附分子的异常表达可能在促进血管壁内细胞增殖、引发炎症以及促成自身免疫疾病的发生中发挥作用[46]。流体空间中的流速主要由其黏度决定，而黏度还受溶解离子、抗体、血小板、红细胞和白细胞存在与否的影响[47]。细胞的弹性和其动态形态变化有助于其通过毛细血管，在某些区域仅能容纳单个红细胞[48]，[49]。作用在血管壁（即淋巴管）上的切向力被称为剪切力。流动形态可以是层流的，此时流体在血管中心处流速最快，靠近血管壁时流速降低[50]，[51]。尽管心血管系统中的血流大多为层流，但由于心脏周期的搏动特性，混沌对流和过渡流经常发生，并在血管变形部位（包括正常的动脉分叉以及动脉瘤或动脉粥样硬化斑块等病理性特征）得到放大。内皮细胞与血流直接接触。流动的血流刺激内皮细胞，内皮细胞对此分泌各种物质，如一氧化氮或前列环素[52]。研究已证明，高剪切力会影响内皮细胞的功能以及其分泌的细胞外成分的质量，从而参与调控其功能[53]。长期暴露于高剪切力已证实可诱导一氧化氮的产生，从而松弛血管。此外，长期高剪切力已被证明可激活机械转导通路并诱导某些基因表达的增强[54]。长期暴露于高剪切力已被证明会导致内皮细胞退化。表现出最低剪切应力的区域是血管分叉处，此处动脉粥样硬化的发生更为常见[55]。当剪切力存在振荡时，可能诱导促炎反应，进而触发单核细胞和部分淋巴细胞的内皮黏附。内皮细胞上表达具有不同功能的机械感受受体。整合素通过细胞外基质进行感知，血小板内皮细胞黏附分子-1（PECMA-1）将机械信号传递至细胞内空间，血管内皮钙黏蛋白增强细胞间连接，在一定程度上稳定血管壁结构，而离子通道（如Piezo-1和TRPV4受体）则调节钙离子摄取[56]，[57]，[58]。在氧化应激条件下，内皮细胞通过产生NOX2和NOX4 NADPH氧化酶发挥抗炎作用[59]，[60]。在单细胞水平上研究黏附相互作用是一项极为复杂的任务，但也是许多生命科学研究领域中的基础性课题。参与细胞黏附的生物分子包括钙黏蛋白、整合素、选择素和免疫球蛋白[61]，[62]。黏附分子通过黏着斑复合体（FAs）与细胞骨架肌动蛋白丝结合[63]。钙黏蛋白负责细胞间连接，而整合素负责与细胞外基质的黏附[64]。选择素和免疫球蛋白参与免疫反应和血管网络[65]，[66]。在肿瘤病变中，单个细胞脱离其组织，即细胞间钙黏蛋白连接减少，上皮-间充质转化增强[67]。所监测表面的功能性可能因实验性质而异。对于细胞黏附介导，表面功能化可能是可行的途径。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp或RGD）基序是一种胞外多肽，能够控制细胞黏附机制，这些机制是整合素蛋白激活和聚集的关键，而在细胞黏附、铺展和信号转导中起着基础性作用[68]，[69]，[70]。章节摘要细胞培养测量中使用了HeLa细胞系（图1c）。细胞在37°C、含5%（v/v）CO?的加湿培养箱中维持。使用Dulbecco改良 Eagle 培养基（D-MEM）维持细胞系，并补充10%（w/v）胎牛血清。此外，培养基中还加入了4 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。当使用2500个细胞时，HeLa细胞悬液的密度经证明最为理想。基于CFD模拟与细胞波长移动响应的平行分析的优化方法学原理我们开发了一个用于解释机械化学响应的综合框架。我们的目标是解读单细胞响应并探索其生物学意义。利用我们的流体旋转系统，通过调节旋转系统的频率（该系统放置在RWG传感器上），我们分析了细胞在多种旋转频率下对机械刺激的响应信号。在实验的第二阶段，我们将独特的细胞响应信号与……进行了比较。结论正如表1总结中所述，尽管已建立的宏观和微流控平台可以提供精确的剪切力控制或复杂的三维几何结构，但它们不可避免地需要在制造复杂性、高通量平行化和实时单细胞分辨之间做出权衡——我们的RWG生物传感器结合磁旋转系统，旨在弥合这一方法学空白，从而实现对单细胞水平机械性质的分析。作者贡献Igor Sallai和Dános Sebestyén Varga负责开发和调试仪器及软件，进行实验、分析结果、制作图表并撰写稿件。Benjamin Csippa使用Ansys进行计算流体动力学（CFD）模拟并参与撰写。Bálint Béres开发了处理原始DMR数据的代码并参与撰写。Zoltán Szittner协助制作图表中的矢量图形。Inna Székács负责细胞培养维护。致谢本项目由匈牙利科学院Momentum（Lendület）计划和匈牙利国家研究、发展和创新基金（NKFIH）资助，项目编号TKP2021-EGA-04、ADVANCED 153121和2024-1.2.10-TéT-IPARI-IL-2024-00030。本研究由ERC_HU、KKP_19项目及PD 134195资助（授予Z.S.）。本文得到匈牙利科学院János Bolyai研究奖学金（授予Z.S.）和博士卓越奖学金的支持。I. Sallai|D.S. Varga|B. Csippa|B. Béres|Z. Szittner|I. Székács|A. Dér|A. Bonyár|R. Horvath