基于光响应产气聚合物的单细胞微腔阵列芯片实现单细胞捕获与区域选择性回收方法研究

《Sensors and Actuators A: Physical》：Single-cell trapping and region-selective retrieval method using light-responsive gas-generating polymer-based single-cell microchamber array chip

　　

摘要专业翻译 单细胞捕获与选择性回收对于再生医学、药物发现、基因治疗和单细胞分析等领域的进步至关重要。本研究开发了一种基于光响应产气聚合物（light-responsive gas-generating polymer, LGP）微腔阵列（LGP-MA）芯片的单细胞捕获与快速单细胞回收方法，该芯片利用LGP产生的N2气体实现细胞释放。LGP-MA芯片通过将LGP嵌入聚苯乙烯（polystyrene, PS）微阵列芯片的微腔中制备而成。研究人员评估了所制备LGP-MA的制造精度以及LGP对激发光的自发荧光响应。将人胶质母细胞瘤（胶质瘤）细胞系U-87细胞捕获于胶原蛋白包被的LGP微腔中，并通过UVA（波长360–370 nm）照射诱导LGP产生N2气泡，从而选择性回收目标细胞。实验结果显示，单细胞占据率达到42.4±7.4%，约为先前方法的3倍；N2气体生成可在10秒内将捕获细胞推出微腔。回收的细胞被转移至标准96孔板中进行培养，以评估该单细胞捕获与回收方法的有效性。该LGP-MA芯片无需外部连接（如导线或管路），仅使用标准倒置显微镜即可实现低损伤的细胞释放，为稀有细胞（如循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs））的分析与回收提供了高效、低应力的技术方案。

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一、研究背景与问题

单细胞捕获与选择性回收是再生医学、药物发现、基因治疗及单细胞分析等前沿领域的关键技术需求。与培养皿中异质细胞群体的分析不同，从群体中高效、低应力地分离特定突变细胞（即选择性回收方法）对于精确的单细胞基因分析、转录组分析和蛋白质组分析至关重要。微阵列芯片凭借其多个可隔离单细胞的微腔结构，已被广泛用于单细胞捕获与选择性回收。通过在微腔内部涂覆细胞外基质（extracellular matrix, ECM），可增强细胞粘附并提高生物相容性，从而在长时间培养过程中减少物理损伤，支持包括时间序列变化监测在内的纵向细胞分析。这一特性对于分析循环肿瘤细胞（CTCs，出现频率低于0.0001%）、循环胶质瘤细胞（CGCs）和耐药癌细胞等极稀有细胞尤为有利。

然而，现有技术面临多重挑战。首先，从微腔表面回收强粘附细胞同时最小化细胞损伤仍是难题，稳定单细胞捕获与低损伤回收之间存在权衡。其次，已有的细胞释放技术（如微电极、细胞片层、光降解材料等）依赖细胞-粘附界面的化学反应，可能无法充分利用ECM等涂层为特定细胞粘附创建最适基质表面。更重要的是，即使能选择性降低微腔与捕获细胞间的粘附力，这些技术也无法将细胞从微腔中推出以确保回收。介电泳（dielectrophoresis）虽可实现微通道内单细胞的选择性诱导，但该方法需要在芯片上集成夹持细胞的微电极并构建封闭微流控系统，阻碍了显微操作器的使用，且系统复杂度高，细胞提取力受细胞尺寸和复介电常数影响，难以针对多样化的生物来源细胞确定最优条件。

二、研究内容与结论

针对上述问题，研究人员开发了一种基于光响应产气聚合物（LGP）微腔阵列（LGP-MA）芯片的单细胞捕获与快速选择性回收方法。LGP是一种在波长360–370 nm的紫外A（UVA）光照射下产生N₂气体的聚合物，其产气体积至少为聚合物原始体积的10倍，可使粘附于LGP表面的细胞即使在培养三天并铺展后也能轻松释放。LGP-MA芯片由嵌入LGP的PS微阵列芯片构成，每个微腔底部含有LGP。芯片表面涂覆针对目标细胞类型粘附优化的材料。将细胞悬液滴加至芯片后，单个细胞被捕获于LGP微腔中。通过倒置荧光显微镜观察捕获的单细胞并识别目标细胞，将物镜定位于目标细胞正下方并切换滤光片照射UVA光，LGP产生N₂气泡，将单细胞从LGP表面释放并推出微腔，最后用微量移液器收集释放的细胞。

研究采用表达绿色荧光蛋白（GFP）的人胶质母细胞瘤U-87细胞系进行验证。实验结果表明，单细胞占据率随微腔直径增大而提高，四种图案（Pattern 1至4）的占据率分别为22.4±4.8%、24.0±5.7%、27.2±5.9%和42.4±7.4%，其中Pattern 4达到最大值，约为先前方法（12.47±3.90%）的3倍。所有尺寸的LGP微腔中，未捕获而粘附于PS表面的细胞平均每平方毫米少于10个，显著低于先前研究。在回收实验中，针对四种尺寸各125个微腔（共500个）进行操作，共获得122个单细胞，所有目标细胞均被推出微腔并成功回收。每次回收操作（包括UVA照射和吸取）约需20秒。LGP微腔尺寸变异系数（CV）为直径0.7–3.8%，单细胞占据率CV为17–24%，优于先前研究（31%），表明该方法具有良好的可重复性。回收的细胞转移至96孔板培养14天后仍可正常生长，验证了低损伤回收的有效性。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下几项关键的技术方法：第一，LGP-MA芯片的制备，通过将LGP主剂（含叠氮缩水甘油醚聚合物和光敏剂2-异丙基噻吨酮，体积比100:3）与交联剂（聚-2-(2-乙氧基乙氧基)乙基丙烯酸酯）按20:1体积比混合后嵌入PS微阵列芯片的微腔中，室温固化过夜完成；第二，荧光显微观察技术，利用倒置荧光显微镜和CCD相机，通过U-FBNA滤光片（激发470–495 nm，发射510–550 nm）观察GFP表达的U-87细胞，并通过图像分析软件（ImageJ）测量荧光强度；第三，UVA诱导的N₂气泡生成与细胞释放技术，切换至U-FUNA滤光片（激发360–370 nm，发射420–460 nm），在122.7–424.0 mW/cm2辐照度下照射1–10秒，使LGP产生N₂气泡将细胞推出微腔；第四，单细胞回收与培养验证，使用普通商用移液器收集释放的细胞，经离心后转移至96孔板培养，14天后观察细胞生长状态。

四、研究结果

3.1 LGP-MA的制备结果

通过扫描电子显微镜和白光干涉仪对制备的LGP-MA进行表征，四种图案的LGP微腔直径和深度分别为31–46 μm和5.1–7.6 μm。PS表面未观察到裂纹或其他损伤。该制备方法无需溅射或热蒸发等专用设备，不涉及危险化学品或高温环境，工艺简单且适用于耐热温度低于100°C、化学耐受性有限的PS基底，有利于低成本批量生产。

3.2 使用LGP-MA进行U-87细胞的荧光观察

使用U-FBNA滤光片时，LGP微腔中U-87细胞的归一化荧光强度约为空LGP微腔的10倍。LGP的自发荧光显著低于U-87细胞，因此可通过图像分析软件自动识别U-87细胞。LGP自发荧光不干扰细胞观察，荧光成像过程中未观察到LGP自发荧光或微腔结构带来的显著限制。

3.3 LGP微腔中的单细胞捕获

单细胞占据率随微腔直径增大而提高，Pattern 1至4分别为22.4±4.8%、24.0±5.7%、27.2±5.9%和42.4±7.4%。Pattern 1和2未观察到含多个细胞的微腔，Pattern 3和4出现少量多细胞微腔。荧光图像显示捕获的单细胞大致位于微腔中心。所有尺寸下，未捕获而粘附于PS表面的细胞平均每平方毫米少于10个，显著低于先前使用凸起LGP微阵列的研究，表明LGP-MA有效减少了微腔外多余细胞的数量。

3.4 使用LGP-MA进行单细胞区域选择性回收

荧光图像记录了完整的回收过程：U-87细胞悬液铺展并去除多余细胞后，16个微腔中有6个捕获了单细胞，1个细胞粘附于PS表面。切换至U-FUNA滤光片照射约3秒后，LGP产生的N₂气泡将细胞完全推出微腔。切换回U-FBNA滤光片停止产气后，用微量移液器收集推出的细胞。值得注意的是，粘附于PS表面微腔外的细胞未被释放，验证了区域选择性。共对500个微腔（每种尺寸125个）进行回收操作，122个目标单细胞全部被推出并回收，回收率为100%。LGP微腔的释放功能对其直径（31–46 μm）和深度（5.1–7.6 μm）的制造误差不敏感。

五、讨论与结论

讨论部分总结： 先前基于LGP的研究虽已证明其选择性释放细胞的有效性，但依赖泊松分布的自然沉降，单细胞捕获效率仅为12.47±3.90%，且LGP结构尺寸超过100 μm，限制了单芯片上的结构数量，每76.0 mm × 25.5 mm基底上可回收的单细胞数仅为2,612个。本研究提出的LGP-MA显著提高了LGP微腔的集成密度，理论上可在单个76.0 mm × 25.5 mm基底上制造至少50,000个LGP微腔。Pattern 4设计的最大单细胞占据率达42.4±7.4%，约为先前研究的3倍。虽然先前研究使用HeLa细胞而本研究使用U-87细胞，直接比较存在一定局限，但LGP-MA在集成密度和捕获效率上的优势是明确的。此外，与依赖高功率激光和局部加热产生光热气泡的传统气泡式细胞操作技术相比，LGP方法仅使用标准倒置显微镜即可无热产生气泡，实现低损伤细胞释放。

研究结论翻译： 本研究开发了一种基于LGP-MA芯片的单细胞捕获和快速单细胞回收方法，该芯片利用LGP产生的N₂气体实现细胞释放。LGP-MA芯片通过将LGP嵌入PS微阵列芯片的微腔中制备，制造精度良好且LGP自发荧光不干扰细胞观察。U-87细胞在胶原蛋白包被的LGP微腔中被捕获，并通过UVA照射诱导N₂气泡生成实现选择性回收。单细胞占据率达到42.4±7.4%，约为先前方法的3倍，N₂气体生成可在10秒内将捕获细胞推出微腔。回收的细胞转移至标准96孔板后可正常培养，验证了该方法的有效性。LGP-MA芯片无需外部连接，仅使用标准倒置显微镜即可实现低损伤细胞释放，为单细胞分析、稀有细胞回收和克隆培养等领域提供了一种高效、低应力、高集成度的技术方案。