通过硼酸酯亲和力招募酶标记用于核酸超灵敏电化学检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Recruitment of enzyme labels via boronate affinity for ultrasensitive electrochemical detection of nucleic acids

　　• 介绍了一种用于核酸检测的酶基电化学生物传感器。• 利用硼酸亲和性实现对酶标记物的位点可控募集。• 无需使用靶标特异性的偶联检测探针即可实现酶标记物的募集。• 该生物传感器在核酸检测中表现出高灵敏度和高选择性。引言高灵敏度和高选择性的核酸检测对多种遗传性疾病、传染性疾病和肿瘤疾病的体外诊断至关重要。利用诸如单链（ss）DNA [1]、锁核酸（LNA）[2]、肽核酸（PNA）[3]、[4]、吗啉代寡聚物 [5] 以及发夹型DNA探针 [6]、[7] 对靶标进行片段特异性捕获，目前已开发出多种用于核酸检测的生物传感器，例如光电化学传感器 [8]、[9]、[10]，化学发光传感器 [11]、[12]，电化学传感器 [13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18] 和电化学发光传感器 [19]、[20]。得益于酶良好的可获得性和温和的反应条件，已有多种酶催化放大生物传感器被用于核酸检测 [21]、[22]。例如，Bartolome等人开发了一种用于DNA检测的夹心电化学生物传感器，检测限（LoD）为0.54 nM [23]，其中使用了DNA捕获探针和辣根过氧化物酶（HRP）偶联的DNA检测探针。基于LNA捕获探针与生物素偶联的LNA检测探针对面靶标的夹心识别，Wang等人开发了一种HRP放大的电化学生物传感器，用于DNA检测，检测限为74 fM [2]，其中酶标记物通过生物素-亲和素结合进行募集。基于以3-吲哚磷酸为底物的碱性磷酸酶（ALP）引发的银沉积反应，Fanjul-Bolado等人开发了一种检测限约为1.2 pM的夹心电化学生物传感器用于DNA检测，其中检测探针偶联了异硫氰酸荧光素（FITC）标签，以便通过FITC标签与抗FITC抗体之间的相互作用进一步募集酶标记物 [24]。同样地，Mandli等人开发了一种ALP放大的夹心电化学生物传感器用于microRNA检测，检测限为0.1 nM [25]，其中检测探针偶联了生物素标签，酶标记物通过生物素-链霉亲和素相互作用进行募集。尽管通过偶联检测探针募集酶标记物已成为酶催化放大核酸检测中的常用手段，但制备靶标特异性偶联检测探针的高成本与繁琐操作，以及通过靶标特异性检测探针募集酶标记物的缺乏通用性，均不利于诊断应用。因此，亟需开发新的酶标记物募集方法用于酶催化放大的核酸检测。由于糖基化修饰，大多数酶本质上是糖蛋白 [26]。例如，葡萄糖氧化酶（GOx）是一种同源二聚体糖蛋白，其N-连接和O-连接的糖链占该氧化还原酶总质量的11?16% [27]。HRP是一种单链糖蛋白，所连接的8条N-连接糖链大约占该酶c亚型总质量的21.8% [28]。作为一种同源二聚体膜结合糖蛋白，ALP的N-连接糖链分别占人肝和肠同工酶总质量的33% [29] 和16.7% [30]。从结构上看，这些酶的糖链主要由甘露糖、半乳糖和N-乙酰氨基糖残基组成 [28]、[31]。糖链的一个显著特征是存在多元醇基团，特别是可与硼酸配体形成共价交联的顺式二醇位点 [32]、[33]、[34]。硼酸亲和性非常稳健，已被广泛用于糖类及糖结合靶标的分离与分析 [35]、[36]，例如糖蛋白 [37]、[38] 和内毒素 [39]。然而，据我们所知，目前尚无报道通过硼酸亲和性募集酶标记物用于核酸检测。利用稳健的硼酸亲和性实现酶标记物募集，本文开发了一种酶催化放大的电化学生物传感器，用于核酸的超灵敏检测。图1所示为检测原理。该方法中，靶标片段由PNA探针进行捕获。由于PNA的骨架由重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成，而非天然核酸中观察到的(脱氧)核糖磷酸重复单元 [40]、[41]，因此PNA探针上没有磷酸基团 [3]。因此，PNA探针捕获靶标片段的同时引入了磷酸位点，随后通过磷酸-锆(IV)-羧酸盐（PZrC）化学 [3]、[42] 将4-羧基苯硼酸（CPBA）标签连接到这些磷酸位点上。由于每个磷酸位点均可连接一个CPBA标签，因此可提供大量的PBA基团，用于通过硼酸亲和性进一步募集酶标记物。使用PNA探针的其他优点包括：对核酸酶和蛋白酶具有高度抗性、所得异源双链具有更高的热稳定性，以及针对单个碱基错配的高特异性 [43]、[44]、[45]、[46]，等等。以ALP作为概念验证用的酶标记物，以L-抗坏血酸2-磷酸（AAPi）为底物，酶促反应可产生大量抗坏血酸（AA），从而带来高密度的银颗粒沉积，用于伏安法分析 [26]。在2小时内，DNA检测的检测限达到0.15 fM。此外，还展示了高选择性和在血清中用于核酸检测的良好适用性。由于通过硼酸亲和性募集酶标记物可避免使用靶标特异性的偶联检测探针，因此该方法用户友好且成本低廉。鉴于这些优点，该电化学生物传感器被认为非常适用于即时检测场景中的核酸超灵敏检测。章节摘要材料与试剂巯基偶联的PNA探针由Panagene（韩国）合成（序列：5’-SH-(CH?)?-TTAAC TGCACT TCC ACT GTATAT C-3’）。22 nt靶标片段（Target；5’-GATA TAC AGT GGA AGT GCAGTT-3’）、含单碱基错配（SBM；5’-GATA TAC AGT GGA AGT TCAGTT-3’；错配处以下划线标出）、含三个碱基错配（TBM；5’-GATA TAC AGT AGA AGT TCA CTT-3’；错配处以下划线标出）以及对照序列（Control；5’-CTAC ACT TAATCT ACA AAG TAA-3’）由……提供。电化学生物传感器的表征在酶催化放大的核酸检测中，酶标记物通常通过偶联检测探针（例如酶偶联检测探针、生物素偶联检测探针等）进行募集，存在检测成本高和通用性差等缺点。为了避免为每个靶标繁琐制备偶联检测探针，本方法尝试通过硼酸亲和性募集酶标记物，其工作原理为：结论总之，本文首次开发了一种基于通过硼酸亲和性募集酶标记物的酶催化放大电化学生物传感器，用于核酸的超灵敏检测。与传统的通过靶标特异性偶联检测探针募集酶标记物的方法相比，硼酸亲和性介导的募集方式具有更广泛的通用性和更低的成本。由于通过硼酸亲和性募集酶标记物……CRediT作者贡献声明Yiyi Wang：可视化、验证、软件、研究。Meijia Zhang：验证、软件、研究。Qiong Hu：写作—审阅与编辑、写作—初稿、监督、资源、项目管理、方法论、资金获取、构思。Yan Mao：资源。Li Niu：监督、资源。利益冲突声明作者声明，不存在任何已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。致谢本工作由广东基础与应用基础研究基金资助（项目编号：2026A1515011560）。Yiyi Wang | Meijia Zhang | Qiong Hu | Yan Mao | Li Niu