接穗基因型与土壤磷有效性主导可可树丛枝菌根真菌群落组成

《Rhizosphere》：AMF community composition in Theobroma cacao is predominantly influenced by scion genotype and soil phosphorus availability

　　

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的群落组成受植物基因型、根系性状及环境变量的共同塑造。可可树（Theobroma cacao）是一种菌根依赖型农林复合作物。分别利用与AMF群落组成相关的砧木和接穗遗传变异，有望为可持续可可农林复合系统的发展作出贡献。本研究旨在：（1）表征可可树根系中的AMF群落；（2）评估该群落与接穗及砧木基因型、根系性状及土壤性质之间的关系。研究人员在巴拿马博卡斯德尔托罗省（Bocas del Toro）和埃雷拉省（Herrera）的16个农场中，对81株可可树进行了根系和土壤采样。研究人员分析了AMF群落、接穗与砧木基因型、根系性状（根系经济学空间的四项性状，外加根系磷浓度）及土壤特性。Glomus属是所有样本中的优势属。接穗基因型、根系养分浓度（氮和磷）、海拔及土壤有效磷（available P）成为塑造AMF群落结构的主要变量，而砧木基因型及根系形态性状则无显著影响。上述发现凸显了宿主和环境变量在AMF群落组成中的作用，为通过优化植物-真菌互作实现可可可持续栽培提供了策略依据。

一、研究背景与科学问题

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是一类古老的植物共生真菌，通过增强植物养分吸收和启动免疫防御，在陆地生态系统植物定殖过程中发挥了关键作用。然而，关于这一共生关系的关键方面仍知之甚少，包括单一植物物种内AMF的多样性和群落组成、植物与真菌群落之间互作的调控机制，以及环境变量如何塑造这些AMF群落。对这些互作关系的认知至关重要，因为优化的AMF-植物关系为低投入和有机农业系统（典型的热带农业生态系统）中的可持续农业提供了有前景的解决方案。

可可树（Theobroma cacao）农林复合系统（cacao agroforestry systems，CAFS）是热带地区分布最广的多年生作物系统之一。在巴拿马，约有6000公顷可可由约1400个小农家庭种植。传统上，农民依赖生物和结构多样性，采用低投入的耕作方式。农民整合多种当地植物物种，包括提供木材、果实和关键生态系统功能（如遮荫、土壤肥力和侵蚀控制）的次生树种。嫁接——结合砧木和接穗基因型——是保持遗传多样性、促进植物发育和生产力提升的常用做法。然而，近年来小农面临低可可价格下追求短期产量最大化的压力，这些传统做法常被打乱。尽管AMF具有重要的生态意义，但在热带地区尤其研究不足。这种忽视与对外部投入（如合成肥料和农药）日益增长的依赖同时发生。解决过度依赖外部投入的开放农业系统所面临的挑战，需要重新重视AMF及其他根际微生物组互惠共生成员提供的生态系统服务，同时需要增加植物种内和种间的遗传多样性，并改善土壤管理以支持可持续的AMF共生。

AMF群落在热带农林复合系统中发挥着重要作用。局部范围内，AMF扩展了植物可利用的土壤体积，并与菌根圈中的有益微生物互作，增强作物抗逆性和抗病性；全球范围内，AMF塑造植物群落结构和组成，并促进碳封存。AMF群落组成受生物和非生物因素共同影响，包括植物遗传学、根系性状、土壤条件和周围植被。在热带生态系统中，关键驱动因素包括植物群落动态、土壤性质（如pH和有效磷）以及环境因素（包括降水、温度和海拔）。尽管研究较少，但植物效应对AMF群落丰富度和组成的影响已与根系性状（如比根长（specific root length，SRL）、根直径、根磷和钙浓度）相关联。由于尚不清楚植物性状（包括根系性状）、植物群落动态和环境因素在多大程度上驱动AMF群落组成，因此区分嫁接植物的接穗和砧木遗传身份至关重要。如果AMF组成由植物的碳供应或养分需求驱动，则接穗身份可能比砧木身份更具影响力；相反，如果根形态性状及其与根际的互作占主导地位，则砧木身份预计与AMF群落结构的相关性比接穗身份更强。

本研究旨在表征巴拿马农林复合系统中可可根系内的AMF群落，并评估接穗和砧木基因型、根系性状及环境变量对其组成的影响。为此，研究人员在巴拿马两个地区的16个种植园中，每园选取5棵可可树进行根系采样，对地上和地下植物材料进行SNP分析，并测定土壤和根系性质。具体研究问题包括：（1）不同农场和地区的AMF多样性如何，是否存在与可可树常见关联的AMF分类群？（2）植物遗传学、根系性状和环境变量对AMF群落结构的相对重要性如何？（3）哪些虚拟分类群（virtual taxa，VT，作为AMF物种的分子代理）与特定环境变量相关联？

二、研究设计与方法

研究在巴拿马两个主要可可种植区开展，即博卡斯德尔托罗省和埃雷拉省。两地区在种质组成、种植园年龄、树木密度和管理方式以及气候和土壤性质方面存在差异。共选取16个种植园，每园评估5棵可可树，其中一个农场评估6棵，共81棵树。对每棵树分别采集叶片和根系组织，用于地上和地下组织遗传身份的鉴定。根系组织分为三个子样本，分别用于菌根定殖测定、根系氮磷浓度分析及植物根系DNA分析、根系性状评估和AMF群落分析。

主要技术方法包括：利用96个SNP标记对植物进行基因分型，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）将遗传变异作为独立变量；采用Trouvelot方法测定菌根定殖百分比；利用ImageJ和WinRHIZO软件分析根系扫描图像，测定根直径、比根长和根组织密度（root tissue density，RTD）；采用凯氏定氮法和钼蓝比色法测定根系氮磷浓度；通过巢式PCR扩增SSU/18S rDNA片段并进行Illumina MiSeq测序；使用DADA2流程处理序列，与MaarjAM数据库比对进行虚拟分类群（VT）分类鉴定；运用距离冗余分析（distance-based redundancy analysis，db-RDA）评估植物种质、根系性状和环境变量对AMF群落变异的解释能力；采用指示物种分析（indicator species analysis，ISA）识别与显著变量强关联的VT。

三、研究结果

3.1 样本多样性

从76个稀疏化样本中鉴定出683个ASV，归属于82个AMF虚拟分类群（VT）。95%的ASV归属于Glomus属（69个VT），其余4%分布于Acaulospora（5个VT）、Paraglomus（3个VT）、Claroideoglomus（2个VT）、Diversispora（2个VT）和Redeckera（1个VT）。另有54个ASV（约1%）因与MaarjAM参考数据库的序列相似性低于97%而无法分类，提示至少8个新VT。博卡斯德尔托罗鉴定出72个VT，埃雷拉鉴定出55个VT，其中47个VT为两地区共有。PERMANOVA显示两地区AMF群落组成存在显著差异，但多变量离散度也存在显著差异，ANOSIM的低R值（R = 0.0741）表明区域间群落分离较弱。埃雷拉的多样性构成博卡斯德尔托罗多样性的子集。两地区AMF VT丰富度无显著差异。相比之下，16个农场间的AMF群落组成差异显著，而农场内离散度无显著差异，支持群落组成的差异而非农场内离散度的差异。

3.2 核心AMF菌群

核心AMF菌群定义为存在于超过75%样本中的VT，由6个VT组成。VTX00092 [Glomus]和VTX00069 [Glomus]最为丰富，分别占总读数的26%和21%。其余4个核心菌群VT均属于Glomus属，丰度较低（11%或以下）。

3.3 影响AMF群落组成的变量

基于96个双等位SNP位点的PCA分析显示，接穗PC1解释22.8%的遗传变异，接穗PC2解释9.6%，接穗PC3解释5.8%；砧木PC1解释22.8%，砧木PC2解释9.6%，砧木PC3解释5.5%。接穗PC1和砧木PC1高度相关，反映大量实生树的地上和地下基因型一致；接穗PC2和砧木PC2呈负相关，表明SNP在接穗和砧木间存在差异。

冗余分析中，遗传模型调整R2为4.07%（P = 0.0175），其中接穗PC2是唯一与AMF群落组成显著关联的变量；根系性状模型调整R2为5.56%（P = 0.0015），根N、根P和菌根定殖率与AMF群落组成显著相关；土壤性质模型调整R2为17.76%（P = 0.0001），海拔和有效磷对AMF群落有显著影响。包含所有变量的全模型调整R2为19.95%（P = 0.0001），根P和有效磷与AMF群落组成的关联最强。

3.4 指示物种分析

指示物种分析识别出22个独特VT与至少一个变量显著关联（IndVal > 0.3，p ≤ 0.05）。接穗PC2变量与6个VT（VTX00113、VTX00069、VTX00280、VTX00215、VTX00175、VTX00342）及一个潜在新VT（ASV 388）显著关联。海拔、根P、根N和接穗变量与最多数量的AMF物种表现出显著指示值，表明其与AMF群落组成强关联。多个物种与多个变量表现出强关联，如VTX00113同时与海拔（IndVal = 0.84）和接穗（IndVal = 0.63）相关，提示这些AMF物种在植物基因型间为广适种，但在生态上受海拔或其代理因素约束。

四、讨论与结论

研究发现根N和P浓度及接穗种质与AMF群落组成显著相关。接穗和砧木代表不同的植物区室，接穗主导地上功能（叶片发育、光合作用、果实生产），砧木调控地下过程（养分和水分吸收、根系构型、根际条件）。氮和尤其是磷是光合宿主与其菌根伙伴之间的关键元素。有趣的是，与根系生理相关的性状是模型的显著预测因子，而三个形态学RES性状无显著效应。一个可能的解释是根直径在系统发育上高度保守，变异较低，SRL的变异主要由RTD的变异决定。将根视为圆柱体时，SRL与RTD和根直径之间的负相关是数学上的必然结果。接穗PC2显示接穗与砧木间负相关，表明影响AMF组成的对比性SNP等位基因模式。贡献于接穗遗传谱（接穗PC2）的SNP等位基因映射到基因组多个区域，反映高度分化的遗传背景，许多SNP可能代表与真正功能变异连锁不平衡的标记。

关于接穗与砧木对AMF群落相对影响的文献证据不一。本研究观察到的接穗影响与先前可可研究（砧木对细菌和真菌多样性影响更强）形成对比，但该对比研究使用了ITS序列，而ITS引物已知对AMF物种存在偏倚。在柑橘中，Song等人（2015）报道接穗影响更大，而后续研究（Song等人，2020）发现砧木影响更大，差异可能源于前者包含不同田间环境的基因型，而后者通过单一统一管理田块控制了环境变异。

环境变量方面，海拔和有效磷与AMF群落组成显著相关。海拔可视为其他环境变量的代理，包括地理位置和因不同地质历史导致的土壤性质。全球荟萃分析中，土壤磷有效性是AMF多样性的主要预测因子。尽管本研究的有机管理地块磷范围较窄（0-22 mg/l），有效磷仍对AMF群落组成产生影响。博卡斯德尔托罗的10号农场AMF多样性最低，由VTX00069 [Glomus]主导，与较高土壤磷水平（6.4 mg/l）相吻合；该农场和9号农场由商业公司管理，分别在3年和2.5年前从常规施肥转为有机实践，施肥遗留效应可能部分解释了10号农场AMF多样性降低。

具有显著指示值的AMF物种被认为是这些遗传、根系和环境条件的生物指示物。接穗种质、根P、根N和海拔与AMF组成相关，表现为高IndVal的AMF物种，而有效磷和菌根定殖率具有中等影响。三个VT（VTX00113、ASV 388、VTX00175，均为Glomus属）的IndVal与海拔和接穗相关，提示来自可用AMF库的植物过滤作用。埃雷拉作为高海拔地区，比博卡斯德尔托罗的混合种群拥有更多克里奥罗（Criollo）血统的树木。

本研究中AMF丰富度以Glomus属为主，共69个VT。Glomus在可可系统中被广泛报道为优势AMF，其优势可能反映其定殖能力、生态适应性和该属已描述物种数量众多。Glomus的优势也因MaarjAM数据库中该属的广义界定（包括Funneliformis、Rhizophagus及若干近期确认的分离属）以及有利于Glomeraceae的引物偏倚。基于孢子形态的南美可可农场综述记录了67种，其中37%属于Glomeraceae，而本研究观察到的比例为84%。孢子调查可能偏向于以产孢著称的Glomeraceae成员，且孢子作为休眠结构可能不反映活跃的共生群落。通过分子工具聚焦可可根相关AMF，本研究捕获了已定殖可可根系的共生体。

从本研究鉴定的VT中，26%此前在该地区有报道，74%为新记录，凸显热带可可系统中AMF群落的未充分探索状态。核心AMF菌群中的四个VT（VTX00069、VTX00122、VTX00113、VTX00092）此前在巴拿马巴罗科罗拉多岛和哥斯达黎加蒙特维德有报道，其中VTX00069、VTX00113和VTX00092为全球广泛分布种，而VTX00122和核心菌群的其他两个VT（VTX00397、VTX00270）在全球较少见且为该地区新记录。

埃雷拉的多样性是博卡斯德尔托罗多样性的子集，尽管两者VT丰富度和多样性相似。这种差异可能由博卡斯德尔托罗更密集的采样（11个农场对比5个农场）造成，尤其是随机性（扩散限制）是塑造AMF群落的主要因素。海拔作为环境因素和地质历史的代理，也可能解释埃雷拉某些AMF的缺失。跨农场比较中，博卡斯德尔托罗拥有更多混合种质，而埃雷拉种质更均匀。宿主基因型可调节菌根互作，影响定殖水平和养分交换，可能改变物种丰度。管理实践也存在差异：埃雷拉的农场管理更集约，频繁修剪和较低遮荫水平，而博卡斯德尔托罗遮荫更高、修剪更少。

研究结论

大多数AMF研究集中于温带地区，尽管这些真菌在推进热带生态系统农业方面具有巨大潜力。在本项巴拿马AMF群落研究中，Glomus属为优势属。接穗基因型、根系养分浓度（N和P）、海拔和土壤有效磷成为可能塑造AMF群落的显著因素，而砧木基因型和根系形态性状无显著影响。这些发现强调了宿主和环境因素在AMF组成中的重要性，并提示通过优化植物-真菌互作改善可持续可可栽培的机会。未来研究应探索：（1）接穗驱动的代谢需求或碳分配如何在多变的环境约束下影响AMF群落；（2）如何优化接穗种质以支持低投入热带农业中高效的AMF共生。