多重耐药和高毒力肺炎克雷伯菌分离株表型与基因型的交互作用——基于孟加拉国南部的研究

《Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology》：Interplay Between Phenotype and Genotype in Multidrug-Resistant and Hypervirulent Klebsiella pneumoniae Isolates From Southern Bangladesh

　　

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, Kpn）是一种机会致病菌，与多种疾病相关，且因高毒力和多重耐药（multidrug-resistant, MDR）菌株带来的治疗挑战，导致显著的发病率和死亡率。本研究调查了Kpn分离株的抗菌药物耐药性、毒力因子及克隆多样性的流行情况。研究人员从孟加拉国吉大港两家三级医院的病历登记处共收集了704份记录，并从中选取了123株经生化确认的临床克雷伯菌属（Klebsiella）分离株用于分子分析。测定了抗菌药物敏感性、高黏液表型以及抗菌药物耐药（antimicrobial resistance, AMR）基因（sul1、aadB）和高毒力基因（rmpA）的存在情况，并对一株耐药性最强的分离株进行了全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）。在所有分离株（n = 704）中，72.59%为MDR，18.89%为双药耐药（double drug-resistant, DDR），7.95%为单药耐药（single drug-resistant, SDR）。在MDR中，医院获得性感染（76%）比社区获得性感染（24%）更普遍，且在老年（27%）和儿童（25%）患者中比例更高。分离株对第三代头孢菌素表现出高度耐药，对粘菌素敏感性最高。对81株phoE阳性分离株的PCR分析显示，85.18%携带sul1基因，6.17%携带aadB基因；此外，12.34%携带毒力基因rmpA，1.24%同时携带sul1、aadB和rmpA三种基因。在分离株中，65.43%拉丝试验阳性。值得注意的是，与拉丝试验阴性菌株相比，这些拉丝试验阳性菌株对大多数受试抗生素表现出耐药性。全基因组测序证实KP-CU-1为肺炎克雷伯菌，其草稿基因组大小为5.26 Mbp，N50为164,530 bp，被归类为序列型29（sequence type 29, ST29）。本研究表明，MDR Kpn高度流行，且高毒力菌株比例较高。建立全国性AMR监测网络对于控制MDR和高毒力Kpn在孟加拉国的传播至关重要。

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, Kpn）是临床上最重要的多重耐药（multidrug-resistant, MDR）病原体之一，常引起医疗保健相关感染。高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent K. pneumoniae, hvKp）与经典肺炎克雷伯菌（classical K. pneumoniae, cKp）不同，其可在健康社区人群及医疗环境中引发严重感染，且常表现为高黏液表型，可通过拉丝试验（粘性拉丝>5 mm）初步鉴定，并携带rmpA、rmpA2、iucA、iroB等毒力基因。近年来，高毒力与多重耐药性在Kpn中逐渐趋同，形成“超级细菌”，对临床治疗构成严峻挑战。目前孟加拉国关于Kpn的研究多局限于表型或分子水平，缺乏基于全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）的长期综合监测。本研究旨在整合流行病学记录分析、抗菌药物敏感性谱、拉丝试验、靶向PCR和WGS，探讨孟加拉国吉大港三级医院中MDR与高毒力Kpn表型及基因型之间的关联。

研究人员从吉大港两家三级医院（Chattogram Maa-O-Shishu Hospital和Chevron Clinical Laboratory）的病历登记处收集了2023年11月至2024年8月间704例实验室确诊Kpn感染病例进行流行病学分析，并从中获取123株非重复临床分离株（来源于尿液、血液、气管抽吸物、痰液、脓液、伤口拭子和阴道拭子）用于分子研究。通过拉丝试验评估高黏液表型，利用Kirby-Bauer纸片扩散法测定抗菌药物敏感性，采用PCR检测Kpn特异性基因phoE、耐药基因sul1和aadB以及毒力基因rmpA，并对一株代表性MDR分离株（KP-CU-1）进行Illumina iSeq100平台WGS。测序数据经SPAdes组装后，使用Kleborate等工具进行序列分型、耐药基因和毒力基因注释。样本队列来源于孟加拉国吉大港的住院及门诊患者，年龄覆盖儿童至老年人。

### 3.1 Kpn分离株的人口统计学分布与临床特征

在704例Kpn感染病例中，MDR占72.59%，双药耐药（double drug-resistant, DDR）占18.89%，单药耐药（single drug-resistant, SDR）占7.95%。医院获得性感染（76%）显著高于社区获得性感染（24%）（p = 0.034）。MDR在老年（≥60岁）患者中比例最高（27%），其次为儿童（25%）；城市地区（58%）的MDR感染负担高于农村（42%）。住院患者中气管抽吸物（30.46%）和痰液（24.9%）是最常见的标本来源，而门诊患者中以尿液（45.6%）为主。重症感染多见于重症监护病房（ICU）（30%）和内科病房（22%）。

### 3.2 Kpn分离株的MDR模式

抗菌药物敏感性测试显示，分离株对头孢他啶、头孢呋辛和头孢克肟的耐药率最高，均超过80%；对粘菌素和呋喃妥因的敏感率超过70%。成人患者对头孢呋辛和头孢克肟的耐药率分别高达40.19%和33.94%，高于儿童和老年组。PCR筛查81株phoE阳性分离株发现，85.18%携带sul1基因，6.17%携带aadB基因，12.34%携带rmpA基因，1.24%同时携带sul1、aadB和rmpA。sul1基因阳性株主要来自住院患者（67.9%）、老年患者（30.86%）和气管抽吸物标本（53.09%）；rmpA基因主要存在于住院患者（12.34%）和气管抽吸物（8.64%）中。

### 3.3 拉丝试验鉴定高黏液表型

65.43%（53/81）的phoE阳性Kpn分离株拉丝试验阳性。在这些高黏液表型菌株中，81.13%携带sul1，7.55%携带aadB，7.41%携带rmpA，且以气管抽吸物来源居多（41.97%）。拉丝试验阳性菌株对大多数测试抗生素的耐药率高于拉丝试验阴性菌株，提示高黏液表型可能与抗菌药物耐药性相关。

### 3.4 Spearman相关矩阵分析

相关性分析显示，耐药基因sul1和aadB与氨基糖苷类及氟喹诺酮类耐药呈正相关，提示可能存在共选择机制。拉丝试验阳性和rmpA基因与多种抗生素耐药呈弱至中度正相关，反映出耐药与毒力特征的趋同趋势。碳青霉烯耐药与β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合呈正相关，而呋喃妥因耐药则与其他抗生素类别呈弱或负相关，提示其耐药机制可能不同。

### 3.5 MDR Kpn的全基因组分析

#### 3.5.1 基因注释与子系统分类

KP-CU-1的WGS确认其为Kpn，草稿基因组为5.26 Mbp，N50为164,530 bp，多基因座序列分型（multilocus sequence typing, MLST）鉴定为ST29。Kleborate预测其荚膜位点为KL54，脂多糖位点为O1。该菌株携带广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases, ESBL）基因bla_CTX-M-15、bla_TEM-1D和染色体编码的bla_SHV-187，以及喹诺酮耐药基因qnrS1、氨基糖苷类耐药基因strA/strB、磺胺类耐药基因sul2和四环素耐药基因tet(A)，未检出碳青霉烯酶基因。Kleborate毒力评分为1，存在耶尔森菌素（yersiniabactin, ybt 14位于ICEKp5）编码簇，但缺乏aerobactin（iuc）、salmochelin（iro）及rmpA/rmpA2等典型高毒力位点。RAST子系统注释显示基因组富含碳水化合物代谢（421个基因）、氨基酸及衍生物代谢（401个基因）和蛋白质代谢（217个基因）等相关功能基因，并包含55个与毒力、疾病和防御相关的基因。

#### 3.5.2 MDR Kpn菌株KP-CU-1的比较基因组分析

比较基因组分析显示KP-CU-1携带多种耐药相关基因，包括来自沙门氏菌的gyrA突变（三氯生耐药）、大肠埃希菌的mdfA（多药外排）、Kpn的ompK37和KpnE（外膜通透性及外排泵）、dfrA12（甲氧苄啶耐药）、AAC(6′)-Ib10（氨基糖苷类耐药）、OXA-9、ANT(3″)-Ia、VEB-1、sul1、erm(42)、marA等，并存在vanG、fosA5、acrB等与万古霉素、磷霉素和多药耐药相关的基因，揭示了该菌株复杂的耐药背景。

讨论部分指出，本研究中MDR Kpn的高检出率与孟加拉国其他研究一致，医院获得性感染比例较高。拉丝试验阳性率（65.43%）高于达卡和埃及的报道。rmpA检出率（12.34%）低于部分先前研究，但仍提示高毒力决定簇的存在。相关分析支持耐药基因与表型耐药之间的关联，但作为观察性研究不能确立因果关系。KP-CU-1被鉴定为ESBL产生、高黏液表型的cKp，尽管缺乏典型高毒力基因，却携带耶尔森菌素和bla_CTX-M-15，显示耐药与毒力特征融合的临床风险。研究优势在于纳入了大量流行病学记录，但分子分析样本量有限，结果外推需谨慎。

研究结论：Kpn因日益增长的MDR、高毒力菌株的出现及其与严重医疗相关感染的关联，已成为重大公共卫生问题。研究人员发现部分Kpn分离株携带高毒力相关特征，包括rmpA阳性和高黏液表型，这尤其令人担忧，需要立即关注。难以治疗的产碳青霉烯酶Kpn菌株的存在需要更多关注以防止其传播。孟加拉国Kpn种群结构与全球高危及高毒力谱系的一致性表明，具有流行病学意义的Kpn菌株可能跨地域传播，凸显了持续进行分子监测、抗菌药物管理和协调公共卫生策略以监测并限制MDR和hvKp在孟加拉国传播的重要性。