TGFβ诱导心脏肌成纤维细胞分化中的阶段性代谢重塑：早期糖酵解激活、葡萄糖碳重分配及线粒体重塑选择性调控胶原积累与收缩

《Redox Biology》：Phasic metabolic remodeling coordinates cardiac myofibroblast differentiation and function

　　

TGFβ在广泛转录重塑之前激活糖酵解。葡萄糖碳随后被重定向进入生物合成池和Krebs循环池。激活的糖酵解是完成肌成纤维细胞转化所必需的，但单独不足够。肌成纤维细胞具有更小且呼吸能力更强的线粒体。代谢节点选择性控制胶原积累和收缩。因此，本研究旨在界定原型促纤维化细胞因子转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGFβ）诱导的代谢重塑的时间特性及功能意义。通过整合细胞外通量分析（extracellular flux analysis）与稳定同位素分辨代谢组学（stable isotope-resolved metabolomics, SIRM），并结合转录组分析（transcriptomic profiling）和已建立的肌成纤维细胞分化标志物，研究人员证明糖酵解激活在TGFβ刺激后早期发生，并且是完全肌成纤维细胞分化所必需但单独不足以实现的过程。此外，研究人员表明代谢扰动所致的表型后果取决于所靶向的糖酵解过程，其中限制葡萄糖支持的糖酵解与抑制甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）依赖的中心糖酵解通量，对单个肌成纤维细胞标志物的诱导和胶原丰度产生不同影响。线粒体活性同样对下游效应功能，尤其是胶原丰度和基质收缩，发挥选择性控制，而不统一调控分化表型的全部特征。总之，这些发现建立了成纤维细胞激活期间代谢重塑的时间与功能框架，并确定可能用于选择性调节纤维化反应的代谢通路和节点特异性检查点。

心脏成纤维细胞在损伤后向肌成纤维细胞分化，伴随大量细胞外基质（extracellular matrix, ECM）合成和收缩机器上调，因而具有很高的能量与生物合成需求。已有研究表明葡萄糖和谷氨酰胺代谢参与调控肌成纤维细胞分化，抑制糖酵解可减弱成纤维细胞激活，但代谢变化相对于TGFβ等激活信号何时发生、是否为纤维化反应所必需或充分，仍不明确。为此，研究人员以转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGFβ）诱导的成年小鼠心脏成纤维细胞为模型，系统解析代谢重塑的时间顺序和功能意义，并将结果发表于《Redox Biology》。研究结论表明，TGFβ诱导阶段性代谢程序：糖酵解早期快速升高，随后葡萄糖碳进入生物合成和线粒体代谢池，并伴随呼吸能力增强；足够糖酵解是完整分化所必需但非充分条件，不同糖酵解和线粒体节点选择性控制胶原积累、标志物表达和收缩。该工作提示代谢重塑不是肌成纤维细胞分化的单纯下游后果，而是分化程序的阶段性组成部分，并识别出可选择性调控纤维化反应的代谢检查点。

关键技术方法方面，样本来源为12–20周龄C57BL/6J小鼠，机制实验主要使用雄性来源的成年小鼠心脏成纤维细胞。主要方法包括：原代心脏成纤维细胞培养与TGFβ/bFGF处理；细胞外通量分析测定细胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR）和氧消耗率（oxygen consumption rate, OCR）；时间分辨bulk RNA-seq；稳定同位素分辨代谢组学（SIRM），以¹³C₆-葡萄糖标记最后6 h；线粒体成像与形态定量；免疫印迹；胶原凝胶收缩实验；GLUT1和GlycoHi腺病毒过表达及药理学代谢干预。以上方法用于评估代谢变化、转录重塑和分化功能之间的关系。

研究结果中，首先，“TGFβ诱导先于肌成纤维细胞形成的早期糖酵解反应”。研究人员对成年小鼠心脏成纤维细胞进行TGFβ或bFGF处理6–48 h，发现骨膜蛋白（periostin, POSTN）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, αSMA）在48 h显著升高；ECAR在TGFβ处理后约1.5 h即上升，而OCR早期下降，OCR/ECAR降低。48 h时OCR、基础呼吸、最大呼吸和储备呼吸能力升高，渗透化细胞中线粒体对多种底物的呼吸增强。结论是糖酵解早期诱导先于呼吸激活和肌成纤维细胞分化。其次，“TGFβ诱导线粒体重塑而不增加呼吸链复合体丰度”。MitoTracker Red共聚焦成像显示，肌成纤维细胞线粒体更小、更圆，而免疫印迹中代表性呼吸复合体亚基变化不大，说明呼吸能力增强伴随线粒体形态重塑而非代表性氧化磷酸化蛋白普遍增加。第三，“TGFβ诱导基因转录变化的时间分辨”。bulk RNA-seq显示，1 h时差异表达基因较少，6 h时大量增加，24 h达峰；早期富集TGFβ反应、葡萄糖代谢和胶原生物合成，6 h后扩展至成纤维细胞激活、糖酵解、谷氨酰胺代谢、脂肪酸氧化和线粒体裂变，12 h后还包括透明质酸合成、三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环和氧化磷酸化等。结论是TGFβ引发阶段性转录程序，早期糖酵解激活随后被转录重塑强化。第四，“稳定同位素分辨代谢组学揭示葡萄糖碳进入分解代谢和生物合成代谢物池的时间变化”。在糖酵解部分，24 h时H-1,6-BP、DHAP和3PG的¹³C富集增加，12 h后乳酸富集增加；在辅助生物合成途径中，12 h后UDP-N-乙酰己糖胺（UDP-N-acetylhexosamine, UDP-HexNAc）、UDP-己糖（UDP-hexose, UDP-Hex）和甘油-3-磷酸（glycerol 3-phosphate, G3P）富集升高，48 h后UDP-己糖醛酸（UDP-hexuronic acid, UDP-HexA）和腺苷一磷酸（adenosine monophosphate, AMP）升高；在Krebs循环中，48 h时多个中间物总¹³C富集增加，citrate的m+2、m+4和m+5增加，malate和aspartate在24 h出现m+3增加。结论是早期糖酵解激活后，葡萄糖碳逐渐进入生物合成池和Krebs循环。第五，“糖酵解调控肌成纤维细胞分化”。半乳糖替代葡萄糖使糖酵解降低约3–4倍而不影响氧化磷酸化，完全废除Col1a1升高，减弱POSTN但不影响αSMA；GAPDH抑制剂koningic acid快速降低ECAR，阻止Col1a1、POSTN和αSMA升高。说明糖酵解速率是分化的重要调节因素，不同代谢节点影响不同标志物。第六，“增强的糖酵解活性不足以驱动肌成纤维细胞分化”。GLUT1或GlycoHi过表达均可提高bFGF处理细胞的糖酵解，但不诱导POSTN、αSMA或胶原，表明糖酵解激活是允许性而非指令性条件。第七，“抑制线粒体电子传递和ATP合成优先抑制胶原丰度而保留肌成纤维细胞标志物诱导”。rotenone或oligomycin处理显著或完全降低Col1a1，而POSTN和αSMA仅小幅降低或不变，提示线粒体活性优先控制胶原积累。第八，“糖酵解和线粒体代谢对肌成纤维细胞收缩活性的影响”。胶原凝胶收缩实验中，koningic acid和rotenone降低TGFβ诱导的收缩，oligomycin反而增加收缩，甚至见于bFGF条件，说明糖酵解和线粒体抑制剂对收缩的调节不同，线粒体ATP合成并非简单必需。

讨论部分认为，该研究支持对肌成纤维细胞分化代谢观的修正：代谢重塑不仅是分化的下游结果，也是TGFβ反应中早期且功能重要的组成部分。TGFβ快速增加糖酵解，而转录重塑逐步发展，葡萄糖碳逐渐重分配至生物合成和线粒体池，后期呼吸能力增强。限制糖酵解损害完整肌成纤维细胞表型，而增加糖酵解不足以启动分化；线粒体代谢操作则更选择性地影响胶原和收缩。由此提出模型：TGFβ信号提供指令，早期糖酵解提供允许性代谢状态，后期转录和线粒体重塑强化特定效应功能。讨论还指出，糖酵解激活早于既往在成纤维细胞中通常观察到的时间；SIRM显示葡萄糖碳进入UDP-HexNAc、UDP-HexA、AMP和G3P等池；不同代谢节点扰动不可互换，因为影响ATP生成、NAD⁺再生、前体分配和信号等不同过程。胶原对糖酵解和线粒体抑制尤为敏感，可能与其高生物合成负担及前体、氧化还原、翻译、加工和运输需求相关。治疗上，需考虑心肌梗死后早期修复性纤维化与后期病理纤维化的时间窗口差异，并应测试保留细胞复杂性的体内模型。研究局限包括bFGF作为主动抗肌成纤维细胞对照而非中性对照、培养基底硬度影响、营养环境、多数机制实验使用雄性来源细胞、固定时长¹³C₆-葡萄糖标记不能量化绝对通量、药理学扰动可能存在靶点外效应等。研究结论翻译为：总之，TGFβ在心脏成纤维细胞中诱导按时间有序的代谢程序，其中糖酵解活性在广泛转录重塑前快速升高，随后在肌成纤维细胞表型发展过程中，葡萄糖衍生碳进入生物合成池和线粒体池增加，呼吸能力增强。足够的糖酵解活性是完全分化所必需但并非独立充分，而扰动不同的糖酵解和线粒体节点会差异影响胶原积累、标志物表达和基质收缩。因此，代谢重塑并非肌成纤维细胞分化的单纯下游结果，而是分化程序的不可或缺的阶段性组成部分。代谢似乎并非支持向“激活”状态的单一二元转变，而是分阶段部署以支持成纤维细胞分化和功能的不同组成部分。