ROS响应型HA修饰CO纳米制剂CPs@HA通过恢复线粒体氧化还原稳态协同抑制肝缺血再灌注损伤中的铁死亡、铜死亡与二硫死亡

《Redox Biology》：CO-mediated restoration of mitochondrial redox homeostasis contributes to alleviating multiple programmed cell deaths in hepatic I/R injury

　　

肝缺血–再灌注损伤（HIRI）仍是肝脏手术和肝移植中危及生命的并发症，且尚无临床批准的治疗方法。研究人员开发了一种透明质酸（HA）修饰的、活性氧（ROS）响应型纳米制剂（CPs@HA），其能够将一氧化碳（CO）可控地递送至受损肝组织。研究表明，线粒体功能障碍与 HIRI 期间平行发生的三种不同细胞死亡通路，即铁死亡（ferroptosis）、铜死亡（cuproptosis）和二硫死亡（disulfidptosis），密切相关。CPs@HA 通过激活 AMPK–SIRT1–PGC-1α 轴并恢复 Ca²⁺ 平衡来恢复线粒体稳态，同时伴随线粒体活性氧（mtROS）爆发受抑、线粒体膜电位（ΔΨm）得以保持、嵴超微结构得以维持以及呼吸复合体（I & IV）和丙酮酸脱氢酶复合体（PDHC）活性得以恢复。ATP 能量供应与 NADPH 还原能力的双重恢复，以及 CO 对氧化应激和炎症的直接抑制作用，与铁死亡、铜死亡和二硫死亡的减弱相关，并与肝组织和细胞模型中的转录组学及功能实验结果一致。因此，CPs@HA 可有效减轻肝损伤。通过以线粒体修复为关键组成部分来中断氧化应激、代谢崩溃和细胞死亡的恶性循环，该研究提示了一种可能针对 HIRI 的统一治疗策略，并表明靶向线粒体稳态可能有助于同步减轻多种细胞死亡程序。

肝缺血–再灌注损伤（HIRI）是肝切除、肝移植和出血性休克的主要并发症，与早期同种异体移植物功能障碍和不良长期预后相关。临床数据显示，621例肝移植受者中53.6%发生早期同种异体移植物功能障碍，90天死亡率为16%，1年移植物存活率仅69.2%。HIRI 的突出矛盾是恢复血流反而加重组织损伤，并可导致急性肝衰竭或多器官功能障碍。尽管研究数十年，仍无有效临床治疗。氧化应激是 HIRI 病理的中心驱动因素：缺血期缺氧损害线粒体结构和 ATP 合成，厌氧代谢增强产生 ROS，使线粒体处于脆弱的“预激活状态”；再灌注时氧骤增触发功能异常电子传递链产生 ROS 爆发，并与细胞内 Ca²⁺ 超载共同诱导线粒体通透性转换孔（mPTP）异常开放，导致膜电位崩溃、结构肿胀和破裂。受损线粒体释放线粒体 DNA 和 ROS，直接损伤脂质、蛋白质和 DNA，并释放损伤相关分子模式（DAMPs）激活先天免疫，形成“氧化应激–炎症”正反馈环。在此微环境中，多种氧化应激调控的程序性细胞死亡通路平行激活，包括铁死亡、铜死亡、二硫死亡和 PANoptosis。它们执行机制不同但均汇聚于线粒体，提示线粒体功能障碍可能是共同损伤位点；然而靶向该线粒体枢纽能否同时抑制这些细胞死亡通路尚未被探索。现有策略如 N-乙酰半胱氨酸或糖皮质激素靶向单一路径且可能增加感染和代谢紊乱风险；缺血预处理有创；亚低温机器灌注昂贵且技术要求高。CO 是血红素加氧酶-1（HO-1）产生的内源性气体信号分子，具有抗氧化、抗炎和线粒体保护特性，可激活 HO-1、下调 ROS 相关基因、上调 SIRT1、抑制 NF-κB 介导炎症，并可逆结合细胞色素 c 氧化酶（复合体 IV），诱导受控线粒体 ROS 信号以激活适应性保护通路并支持线粒体能量代谢，还促进线粒体自噬和生物发生。基于此，研究人员构建了 CPs@HA，即将 CO 供体 CORM-401 负载于聚酰胺-胺（PAMAM）纳米凝胶并以 HA 表面修饰。HA 涂层增强血清稳定性并促进 CD44 介导的肝细胞摄取，使 CPs@HA 优先蓄积并延长滞留于受损肝组织。该研究将 CO 介导的肝保护从已知抗氧化和抗炎作用扩展到线粒体恢复以及铁死亡、铜死亡和二硫死亡相关过程，并将可控 CO 递送与机制研究关联。研究人员在 HIRI 小鼠模型和细胞模型中验证后得出结论：CPs@HA 通过恢复线粒体稳态协同抑制铁死亡、铜死亡和二硫死亡，从而有效减轻肝损伤；该研究提示靶向线粒体稳态可能同步减轻多种细胞死亡程序，为 HIRI 提供潜在统一治疗策略。该论文发表在《Redox Biology》。

关键方法概述：研究人员制备并表征 HA 修饰的 CORM-401@PAMAM 纳米凝胶 CPs@HA，评估其 ROS 响应型 CO 释放、自由基清除、细胞摄取与生物安全性；建立雄性 ICR 小鼠 HIRI 模型，采用血清生化、组织学、免疫荧光、ELISA、RNA-seq、ssGSEA/GSEA、Western blot、JC-1、MitoSOX、Rhod-2、TEM 及线粒体复合体/PDHC/ATP/NADPH 检测；体外采用 RAW264.7 巨噬细胞和 HepG2 细胞，构建 RSL3 诱导铁死亡、Elesclomol（ES）/CuCl₂ 诱导铜死亡和葡萄糖饥饿诱导二硫死亡模型。样本来源：雄性 ICR 小鼠购自北京 SPF Biotech，RAW264.7 和 HepG2 细胞购自武汉 Procell。

研究结果：
2.1 CPs@HA 的合成与表征：通过将 CORM-401 负载到 PAMAM 纳米凝胶并进一步 HA 修饰制备 CPs@HA。动态光散射、透射电镜、元素映射、紫外–可见吸收光谱和电感耦合等离子体发射光谱等显示 HA 修饰成功，CPs@HA 粒径约 252.5 nm、带负电并在血清中稳定；在 H₂O₂ 存在下呈浓度依赖性释放 CO，并能清除 ABTS·⁺、H₂O₂ 和 DPPH·；细胞摄取实验显示 CD44 介导对活化巨噬细胞和 HepG2 细胞的双靶向；在活化巨噬细胞中增强 CO 释放、清除 ROS/H₂O₂、提高 CAT/SOD/GSH-Px 活性、上调 HO-1，抑制 M1 标志并促进 M2 标志，降低 iNOS、TNF-α、IL-1β，增加 CD206、IL-4、Arg-1。

2.2 CPs@HA 在小鼠 HIRI 模型中的治疗效力：确定最佳剂量为 1.5 mg/mL，且 COHb 保持正常。体内成像显示 CPs@HA 在肝内滞留达 24 h，损伤肝中 CO 信号强。CPs@HA 降低血清 ALT、AST、BUN，减少 TUNEL 阳性细胞，改善 H&E 组织形态，降低 8-OHdG，恢复 GSH-Px、SOD、CAT 活性，降低 CD86 并升高 CD206，降低 IL-1β、IL-6，升高 IL-4、IL-10；RNA-seq 显示其逆转 HIRI 转录紊乱，抑制 ROS 相关、NF-κB、TNF 和 IL-17 通路，上调 IL-4/IL-13 信号和 M2 极化基因。

2.3 CPs@HA 抑制 HIRI 中多种细胞死亡：通过 ssGSEA 计算死亡潜力指数，HIRI 升高多种程序性死亡评分，其中铁死亡潜力指数、铜死亡潜力指数和二硫死亡潜力指数最显著；CPs@HA 降低这些指数。验证显示：铁死亡方面恢复 GPX4，降低 MDA、Fe²⁺、GSSG；铜死亡方面降低 Cu⁺，改善 DLAT 寡聚；二硫死亡方面恢复 Cys，改善 F-actin 连续性。

2.4 CPs@HA 调控铁死亡的分子机制：在 RSL3 诱导 HepG2 铁死亡模型中，RNA-seq 显示 CPs@HA 降低铁死亡潜力指数并下调 ROS 和铁死亡通路；Western blot 显示恢复铁储存蛋白 FTH1、FTL、PCBP1，抑制 NCOA4/LC3 铁蛋白自噬轴，降低 Fe²⁺ 和 ROS；恢复 SLC7A11、GCLM、GCLC，提高 GSH 和 GPX4，降低 MDA 和 GSSG，恢复 GSH/GSSG。结论是 CPs@HA 通过铁储存、铁蛋白自噬和 GSH 合成轴抑制脂质过氧化。

2.5 CPs@HA 调控铜死亡的分子机制：在 ES/CuCl₂ 诱导 HepG2 铜死亡模型中，CPs@HA 降低铜死亡潜力指数，下调 FDX1 和 LIAS，降低 Cu⁺，恢复 DLAT 分布；恢复 PDH 活性、ATP、NADPH 和 GSH，降低 GSSG 和 ROS。结论是 CPs@HA 通过调节铜稳态、保护线粒体代谢并恢复氧化还原稳态来抑制铜死亡。

2.6 CPs@HA 调控二硫死亡的分子机制：在葡萄糖饥饿诱导 HepG2 二硫死亡模型中，CPs@HA 降低二硫死亡潜力指数，上调 G6PD，下调 SLC7A11，恢复 G6PD 表达和 NADPH，提高 Cys 和 GSH，降低 GSSG，恢复 FLNA 和 F-actin，降低 ROS，提高 ATP。结论是 CPs@HA 通过恢复还原能力、维持巯基稳态并保护细胞骨架来抑制二硫死亡。

2.7 CPs@HA 介导的线粒体稳态恢复：RNA-seq/GSEA 显示 CPs@HA 下调缺氧反应和氧化应激反应，上调 SIRT1、PPARGC1A（编码 PGC-1α）、HMOX2、SOD1、CAT；Ca²⁺ 相关 GO 从胞质 Ca²⁺ 负荷转向稳态调节。Western blot 显示恢复 p-AMPKα、SIRT1、PGC-1α；Rhod-2 显示线粒体 Ca²⁺ 降低；MitoSOX 显示 mtROS 降低；JC-1 显示 ΔΨm 恢复；TEM 显示线粒体肿胀减轻、嵴恢复；mt-ND1 恢复，PDHC、复合体 I 和 IV 活性恢复，ATP 和 NADPH 恢复。结论是 CPs@HA 通过 AMPK–SIRT1–PGC-1α 轴恢复 Ca²⁺ 稳态，抑制 mtROS，维持 ΔΨm 和结构，恢复呼吸链、ATP 和 NADPH，从而为抑制三种细胞死亡提供共同机制基础。与 PAMAMs@HA、CPs 和 iCPs@HA 相比，CPs@HA 效果最强，提示其依赖 HA 主动靶向和病灶按需 CO 释放。

讨论与局限：该研究强调线粒体功能障碍与铁死亡、铜死亡和二硫死亡相关变化相联系，CPs@HA 通过恢复线粒体稳态并打断氧化应激、代谢崩溃和细胞死亡恶性循环，提示潜在整合治疗机制。局限包括：CPs@HA 在缺血前给药评价预防效果，适用于可预期肝缺血的肝移植和肝切除，但未直接比较缺血前、术中、缺血后给药；研究主要表征分子和功能关联而非完整因果层级；需药理抑制或遗传功能缺失确定 AMPK、SIRT1、PGC-1α 或其他关键线粒体调节因子是否必需；铁死亡、铜死亡和二硫死亡的参与由转录组签名、生化指标、分子标志和通路导向细胞应激模型支持，但未确立每种死亡独立或必需贡献；未正式确立线粒体为共同上游因果枢纽；RNA-seq 和 GSEA 应解释为治疗相关转录签名和候选通路，而非通路激活或因果关系的独立证据。

研究结论翻译：总之，研究人员开发了一种释放 CO 的纳米制剂（CPs@HA），其可减弱 HIRI 中三种与氧化应激相关的程序性细胞死亡通路，即铁死亡、铜死亡和二硫死亡。在小鼠模型中，CPs@HA 减轻肝细胞损伤并恢复肝功能。机制上，研究人员的发现将线粒体功能障碍与这些细胞死亡通路相关变化联系起来。CPs@HA 通过激活 AMPK–SIRT1–PGC-1α 轴、恢复 Ca²⁺ 稳态、保持线粒体完整性并恢复呼吸链活性、ATP 合成和 NADPH 还原能力来恢复线粒体稳态。这伴随氧化应激、代谢崩溃和细胞死亡恶性循环的中断，提示一种潜在整合治疗机制。总之，该研究提供了一个整合框架，将病理微环境响应型 CO 递送与肝保护、线粒体恢复及多种细胞死亡过程调控联系起来。