基于EDTA的步骤精简型人多能干细胞解离方案——适用于Laminin-511 E8片段培养体系

《Regenerative Therapy》：Step-minimized EDTA-based detachment protocol for human pluripotent stem cells cultured on laminin-511 E8 fragment

　　

重组laminin-511 E8片段（LM511E8）是一种高效、无异源成分的人多能干细胞（hPSC）培养基质。然而，hPSCs与LM511E8的牢固粘附在酶处理后通常需要机械刮取，从而损害细胞活力、可重复性和培养可扩展性。方法：研究人员开发了一种步骤精简、基于乙二胺四乙酸（EDTA）、免刮擦的hPSCs解离方案，适用于在LM511E8上培养的细胞。该方案免除了机械刮取和离心，并评估了解离效率、hPSC质量的长期维持、对中等规模培养系统的适用性以及胰蛋白酶样蛋白酶对EDTA介导细胞解离的影响。结果：该方案在操作最少的情况下实现了持续的高解离效率，同时在长期培养中保持了hPSC的多能性和基因组完整性。值得注意的是，在EDTA溶液中加入胰蛋白酶样蛋白酶降低了解离效率，而蛋白酶抑制可恢复该效率。此外，该方法经微小修改即可轻松适应中等规模培养系统（例如多层培养瓶）。结论：研究人员的方案提供了一种高效、可重复且无需离心的解离方法，解决了基于LM511E8培养的技术局限。这种可扩展方法可能促进基础研究和再生医学应用中hPSC的高通量扩增。

人多能干细胞（hPSC）的无异源成分培养体系是再生医学和生物医学应用的重要基础。重组laminin-511 E8片段（LM511E8）因能与hPSC表面的整合素α₆β₁高亲和结合，已成为广泛使用的无异源成分培养基质。然而，hPSC在LM511E8上粘附牢固，常规含胰蛋白酶样蛋白酶的消化液处理后仍需机械刮取才能完全收集细胞，导致细胞活力下降、操作变异性增加，且难以适用于自动化、规模化培养。针对这一技术瓶颈，研究人员建立了一种步骤精简、不含机械刮取和离心的EDTA解离方案，在保证细胞质量的同时实现高效、可重复的传代。

研究人员以两株人诱导多能干细胞系253G1和1383D6为主要对象，系统评估了EDTA浓度、孵育时间、洗涤条件、离心去除解离液的必要性，以及蛋白酶对EDTA解离效率的影响。结果证明，仅用含EDTA的磷酸盐缓冲液结合轻柔吹打即可将LM511E8上贴壁的细胞几乎完全解离，且长期传代后细胞仍保持多能性标志物表达、正常核型及三胚层分化潜能。该方法还可经微小调整用于T-75培养瓶和多层培养瓶等中等规模培养系统。研究还发现，EDTA溶液中加入胰蛋白酶样蛋白酶会降低解离效率，而蛋白酶抑制剂可逆转该效应，提示蛋白酶活性可能通过细胞表面信号通路增强细胞粘附。

主要关键技术方法包括：LM511E8包被培养及无包被直接接种培养；EDTA/EGTA解离实验结合碱性磷酸酶（ALP）染色和ImageJ定量评估残留细胞；台盼蓝排斥法检测细胞活力；蛋白酶活性荧光定量分析；免疫细胞化学、流式细胞术分析多能性标志物（SSEA-4、OCT3/4、NANOG、SOX2）；G显带核型分析；体外三胚层定向分化鉴定。两株hiPSC系253G1和1383D6均来自京都大学iPS细胞研究所。

研究结果分述如下。

一、5 mM EDTA高效解离LM511E8上培养的hiPSCs：对培养7天的253G1和1383D6细胞用5 mM EDTA/PBS处理15分钟后，镜下可见细胞间连接破坏和形态改变，经轻柔反复吹打即可脱离培养板并分散为单细胞，无需机械刮取。

二、EDTA解离方案的建立：比较1 mM与5 mM EDTA以及5、10、15分钟处理时间，发现两种浓度下处理5分钟即可使超过90%细胞脱落，10分钟几乎完全脱落；脱离细胞存活率均高于95%。不同洗涤条件和洗涤次数对解离效率无显著影响。将EDTA解离液随细胞直接接种而不离心去除，细胞仍能形成ALP阳性克隆，说明离心并非必需。据此建立小规模EDTA解离和传代方案：默认5 mM EDTA/PBS处理15分钟，粘附较弱细胞可用1 mM EDTA/PBS处理10分钟。经10代以上传代，细胞增殖良好、保持典型hPSC克隆形态，SSEA-4、OCT3/4、NANOG、SOX2表达正常，核型正常，且具有向三胚层分化的能力。

三、可扩展至更大规模培养系统：采用无包被方法将253G1细胞培养于T-75培养瓶，5 mM EDTA/PBS处理15分钟后，用新鲜培养基替换解离液，并以150 rpm水平振荡1分钟即可使细胞完全脱落，细胞活力为91.0%±4.1%；三层培养瓶同样适用。

四、添加TS降低EDTA处理解离效率：将TrypLE Select（TS）加入EDTA解离液后，处理5至10分钟时残留细胞显著增加，解离效率明显下降；加入250 μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）可完全逆转该效应，而10或50 μg/mL STI无效。蛋白酶活性测定证实250 μg/mL STI可完全灭活TS蛋白酶活性。0.0002%重组胰蛋白酶同样降低解离效率，且可被STI恢复，提示TS的不利作用由其蛋白酶活性介导。

五、EDTA螯合钙离子对hiPSC解离至关重要：与EDTA相比，选择性螯合钙离子的EGTA在1 mM和5 mM浓度下处理10分钟均可解离超过95%细胞，表明EDTA主要通过螯合钙离子、破坏钙依赖性钙粘蛋白介导的细胞间粘附来促进解离。

讨论部分总结认为，传统观点常认为胰蛋白酶有助于细胞解离，但本研究却显示在EDTA解离液中加入胰蛋白酶样蛋白酶会降低hPSC从LM511E8上的脱落效率。这可能与蛋白酶激活蛋白酶激活受体2（PAR2）后增强细胞粘附有关。研究结论可译为：研究人员提出了一种基于EDTA、步骤精简、无需刮擦的hPSC解离方案，无论细胞与培养器皿的粘附强度如何，均可实现高解离效率。该方案在中等规模培养体系中仅需微小调整即可应用，有望用于高通量培养系统，为基础和转化hPSC研究提供稳健且一致的结果。