面向细胞治疗产品非临床生物分布研究的有效直接qPCR定量方法开发与验证

《Regenerative Therapy》：Development of an effective direct qPCR method for cell therapy product quantification in non-clinical biodistribution studies

　　

背景：评估细胞治疗产品（cell therapy products, CTPs）的非临床生物分布（biodistribution, BD）对于预测其在临床试验中的有效性和安全性至关重要。尽管BD通常通过DNA提取后的qPCR（quantitative polymerase chain reaction）定量，但该过程劳动密集、耗时，并受提取产率变异影响，使按器官重量或血容量归一化变得复杂。相比之下，直接qPCR可无需DNA提取而定量裂解样品。在此，研究人员系统开发了一种适用于CTPs BD研究的有效直接qPCR方法。
方法：研究人员使用HLCN061，这是一种来源于人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem, iPS）细胞的基因修饰自然杀伤（natural killer, NK）细胞。含HLCN061细胞的小鼠器官和血液被裂解、稀释，并直接使用人特异性Alu引物组进行实时PCR（real-time PCR）。PCR反应采用耐抑制剂型预混液（master mix）。方法性能通过线性（R²）、扩增效率、相对误差（relative error, RE）、变异系数（coefficient of variation, CV）和定量下限（lower limit of quantification, LLOQ）进行评价。随后，将验证后的方法用于评价静脉给药小鼠后24 h内HLCN061细胞的BD。
结果：在所有组织和血液样本中，R²超过0.99，PCR扩增效率为90%至110%，RE在±25%以内。除一例外，CV值均在25%以内。LLOQ为肝脏、肺、肾脏和心脏0.25个细胞/mg重量；脾和卵巢1个细胞/mg重量；血液0.3个细胞/μL。重量归一化浓度在肺中最高，血液中清除最快。
结论：该直接qPCR方法有效，适合CTPs的非临床BD评估。

由Yoichi Naritomi、Yuka Sato、Kumiko Goto、Yuriko Takeno、Hironobu Kimura、Kouichi Tamura等开展的研究，围绕CTPs（cell therapy products，细胞治疗产品）的非临床BD（biodistribution，生物分布）评价，系统开发并验证了一种直接qPCR（quantitative polymerase chain reaction，定量聚合酶链反应）方法。研究背景在于，理解CTPs的药代动力学对于解释和预测其疗效与毒性至关重要；BD研究通常将CTPs给予实验动物，再定量器官和血液中的CTP来源基因。既往主要使用qPCR，尤其是实时PCR（real-time PCR），近年也有微滴数字PCR（droplet digital PCR）用于更精确定量。但常规qPCR依赖从器官或血液中提取DNA，步骤复杂、耗时，且DNA提取产率变异会使数据基于基因组DNA量，限制按器官重量或血容量进行评价，进而妨碍细胞动力学、药代动力学-药效学（pharmacokinetics-pharmacodynamics, PK-PD）以及定量建模与模拟。加入外源对照基因可校正提取产率，但直接qPCR无需DNA提取，能快速、简单分析，并直接给出每单位器官重量或血容量的细胞浓度。不过，直接qPCR应用于CTPs非临床BD研究报道较少，且缺乏详细的定量灵敏度或验证；同时，裂解缓冲液中的表面活性剂或样品中的抑制剂可能抑制PCR并降低灵敏度。因此，研究人员开展了本项系统开发与验证研究。

研究人员以HLCN061为人类模型细胞。HLCN061是一种来源于人iPS（induced pluripotent stem，诱导多能干细胞）细胞的基因修饰NK（natural killer，自然杀伤）细胞，携带NKG2D-DAP10复合物、IL-15、CD16（F176V）、CCL19和CCR2B，用于难治性实体瘤治疗。qPCR靶向Alu序列，Alu元件为灵长类特异性重复元件，在人基因组中超过100万拷贝，可实现高灵敏细胞定量。在仅给予或掺入HLCN061细胞的实验条件下，Alu信号可解释为来源于HLCN061细胞。研究人员评价了校准曲线线性、PCR扩增效率、定量灵敏度、准确度、精密度和重现性，并通过静脉给药小鼠后的BD研究证明该方法效用。结论认为，该直接qPCR方法有效，适合CTPs非临床BD评估，并可表达为每单位器官重量或血容量的细胞数，这是构建CTPs分布生理学及药代动力学模型所需的形式。

关键技术方法概括如下。样本来源包括：HLCN061由脐带血CD34⁺细胞来源人iPSC经基因修饰后分化为NK细胞；对照小鼠血液和组织来自雌性NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Sug/ShiJic（NOG）小鼠；体内研究使用雌性NOG小鼠，静脉给予5×10⁶ cells/mouse，于5 min、1 h和24 h采集血液及肝、肾、心、肺、脾、卵巢。关键技术为：将组织匀浆或血液与HLCN061标准品及裂解/消化体系混合，65°C孵育制备粗裂解物，稀释后直接进行实时PCR；使用人特异性Alu引物/探针和DirectAce qPCR mix；由校准曲线计算细胞当量，并评价R²、扩增效率、RE、CV和LLOQ，进行Run 1、Run 2和Run 3重现性验证。

研究结果按原文小标题总结。3.1 直接qPCR方法的开发：研究人员比较了DirectAce qPCR mix与常规master mix在肝粗样本3、10、30、100倍稀释下的表现。DirectAce qPCR mix在3倍稀释即可观察到扩增；常规master mix在3倍和10倍稀释下无扩增，仅从30倍稀释开始检测到扩增。DirectAce qPCR mix在10倍稀释下校准曲线R²为0.998、PCR扩增效率为101.8%，满足R²≥0.99和扩增效率90%–110%的标准；常规master mix仅在100倍稀释下达到R²为0.999、扩增效率106.9%。为满足标准，研究人员针对每种器官和血液优化了用于分析的器官重量或血容量、粗样本体积、LLOQ、粗样本稀释倍数和退火温度。Run 1中，各QC浓度下的R²、扩增效率、RE和CV均满足标准。通过比较空白与LLQC样本，LLQC实测浓度与标示值一致，空白样本表观浓度明显较低，支持所选LLOQ的有效性。通过6只NOG小鼠血液的空白与LLOQ掺入样本比较，空白相对LLOQ范围为19.1%–33.7%，所有空白实测浓度均明显低于LLOQ样本；LLOQ处RE为16.0%、CV为17.2%，均符合标准，说明该方法可在小鼠血液基质中准确区分HLCN061细胞。

3.2 方法验证：除Run 1外，Run 2和Run 3使用相同方法进行验证。所有R²均超过0.99，PCR扩增效率均在90%–110%范围内。除心脏样本Run 3 LLQC的CV为25.03%、略超过CV≤25%的标准外，其余RE和CV均在接受范围内。所有RE值中，88.1%落在±20%以内，71.4%落在±15%以内；所有CV值中，96.4%落在20%以内，88.1%落在15%以内。结果说明该方法具有可接受的精密度、准确度和重现性。

3.3 体内研究：静脉给予HLCN061细胞后，肺在5 min至24 h内表现出最高浓度；脾和肾的清除倾向于慢于其他器官；血液清除快于任何器官。卵巢样本因每个时间点由三只动物组织合并制备并作为单样本分析，仅显示单一数值。该体内研究通过直接qPCR定量了器官和血液中的HLCN061细胞浓度。

讨论部分总结：该研究认为直接qPCR方法有效且可行。不同基质中以cells/mg组织表示的LLOQ存在差异，但每PCR反应中LLOQ细胞当量相近，约为0.0054–0.011 cells/reaction；每PCR反应所分析的组织量约为0.0071–0.043 mg tissue/PCR reaction，且与LLOQ细胞当量变化趋势不一致。因此，LLOQ差异主要来自每PCR反应代表组织量不同，而非测定内在性能差异。master mix选择对灵敏度关键，DirectAce qPCR mix可抑制PCR抑制，较常规master mix在更低稀释倍数下满足校准标准；常规master mix重复性不足。用于样品裂解和消化的试剂对建立灵敏直接qPCR也重要。研究人员设定的校准曲线标准为R²≥0.99、扩增效率90%–110%，RE为?25%至25%，CV≤25%；这些RE和CV标准相对严格。各器官和血液需优化不同实验条件，但属一次性开发工作，常规分析可使用既定条件。

关于特异性与选择性，空白样本在所有器官和血液中均低于LLOQ样本，支持所选LLOQ水平；LLQC实测浓度与标示LLOQ一致，RE和CV符合标准。六只小鼠血液中，直接qPCR可可靠区分HLCN061细胞与背景，LLOQ处RE和CV分别为16.0%和17.2%。但每个组织基质仅有单个空白测量，无法评价背景信号分布和变异性，也未评估空白与LLOQ之间的统计学分离；更多空白样本研究可能进一步表征背景信号变异性。Run 1、Run 2和Run 3中，除心脏Run 3 LLQC的CV略高外，其余均满足标准；该轻微例外未明显影响总体精密度或准确度。直接qPCR的关键优势是表达每单位器官重量或血容量的细胞数，这是构建CTPs分布生理学及药代动力学模型所需的形式；而DNA提取qPCR因提取产率变异，数据基于gDNA量，妨碍按重量或体积评价。

讨论还比较了Nakayama et al.报道的方法：其使用微滴数字PCR、靶向LINE-1，并以犬基因组DNA作为外源对照基因校正DNA回收率。本研究直接qPCR对肝、肾、心的LLOQ为0.25 cells/mg，Nakayama et al.报告为0.15 cells/mg；本研究脾和血LLOQ分别为1 cell/mg和0.3 cells/μL，分别约高3倍和5倍。精密度和准确度方面，Nakayama et al.部分RE和CV超过30%，但多数在25%以内，与直接qPCR性能相当。直接qPCR的主要实用优势是消除DNA提取、后续DNA定量及外源对照基因校正流程，简化分析工作流；但实施时需针对基质优化组织量、粗样本体积、稀释倍数和退火温度。靶序列和引物组仍可进一步优化，未来应评价更多Alu引物组及非Alu序列引物。本研究使用实时PCR，Nakayama et al.和Fujita et al.研究了数字PCR；数字PCR据报道准确度和重现性优于实时PCR，将数字PCR应用于直接qPCR是未来挑战；实时PCR通常动态范围更宽，因此高浓度样本用实时PCR、低浓度样本用数字PCR可能合适。体内BD方面，肺水平最高，血液下降最快。直接qPCR可定量每单位器官重量或血容量的细胞数，便于器官与血液间比较；但该方法对其他CTPs的适用性仍需研究。空白样本存在表观背景浓度，但BD研究未包括未处理或载体处理对照动物，因此未直接评价体内背景信号，近LLOQ或后期测量可能受背景影响，需谨慎解释。既往NK细胞给药后BD研究主要报告每总DNA的细胞浓度，本研究提示直接qPCR可能为药代动力学研究提供有效评估。局限包括：需分别优化每种器官和血液条件；仅使用HLCN061细胞和NOG小鼠，其他细胞类型和小鼠需进一步确认；本研究评价CTPs非临床BD，未来可扩展至病毒疗法和核酸治疗等新模态。

研究结论翻译：在这项研究中，研究人员系统开发了一种使用直接qPCR定量器官和血液中细胞浓度的方法，设计用于CTPs非临床BD研究。研究人员使用了可抑制PCR抑制的DirectAce qPCR mix。该预混液在各器官和血液浓度测量中提供了可接受的定量灵敏度、RE、CV和重现性。这些发现证明直接qPCR方法在CTPs非临床BD研究中的可行性。