USP18/DDX5轴通过OPA1改善线粒体形态功能损伤并抑制创伤性脑损伤后神经元凋亡

《Redox Biology》：USP18/DDX5 axis ameliorates mitochondrial morphofunctional damage via OPA1 to inhibit neuronal apoptosis after traumatic brain injury

　　

本研究确定USP18（ubiquitin-specific protease 18，泛素特异性蛋白酶18）是减轻创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）后神经元凋亡和认知障碍的关键神经保护因子，该作用此前未被认识。机制上，USP18直接结合DDX5（DEAD-box helicase 5，DEAD-box解旋酶5），并通过其C61活性位点去除DDX5第470位赖氨酸上的K48连接泛素链（K48-linked ubiquitin chains），从而阻止其蛋白酶体降解（proteasomal degradation）。USP18-DDX5-OPA1（optic atrophy 1，视神经萎缩1）轴连接去泛素化、RNA稳定性和线粒体融合：通过稳定DDX5，USP18增强Opa1 mRNA（messenger RNA，信使RNA）稳定性及OPA1表达，促进线粒体融合并抑制神经元凋亡，最终改善TBI后认知功能障碍。

论文解读

创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI，由头部创伤、突然加速或减速等机械力引起的脑损伤）具有高死亡率和致残率，是全球中青年劳动能力丧失的重要原因。TBI后继发性损伤涉及离子稳态失衡、氧化应激、线粒体功能障碍及细胞死亡通路激活等，但有效神经保护疗法仍有限。线粒体功能障碍在继发损伤中居关键地位，可通过能量代谢受损、活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量、线粒体生物发生受损、线粒体自噬缺陷和钙超载促进神经元死亡，这些过程与线粒体动力学（mitochondrial dynamics，分裂与融合动态调节线粒体形态、数量和功能）密切相关。过度分裂可导致线粒体碎片化、ROS增加和功能障碍；而OPA1（optic atrophy 1，视神经萎缩1）通过重塑线粒体内膜和嵴动力学影响氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）和ROS，减轻线粒体功能障碍。USP18（ubiquitin-specific protease 18，泛素特异性蛋白酶18）是多功能去泛素化酶，参与免疫稳态、凋亡、炎症和代谢，但其在神经系统尤其TBI中的作用尚不明确。DDX5（DEAD-box helicase 5，DEAD-box解旋酶5）参与核糖体生成、可变剪接、转录调控和凋亡，其下调可抑制增殖并诱导凋亡，DDX5缺失还可降低细胞内琥珀酸并导致线粒体功能障碍。因此，研究人员系统研究USP18在TBI中的作用。该研究发表于《Redox Biology》。通过多组学分析和实验验证，研究人员发现TBI小鼠海马神经元中USP18表达降低；神经元特异性AAV介导过表达和神经元特异性条件敲除证明，USP18通过逆转TBI后线粒体形态功能缺陷，抑制神经元凋亡并改善认知功能。机制上，USP18直接结合DDX5，通过其C61活性位点催化DDX5 K470去泛素化，稳定DDX5，增加Opa1 mRNA稳定性，促进线粒体融合，改善线粒体功能障碍。该研究揭示了一种USP18依赖性神经保护机制，即通过DDX5-OPA1轴维持神经元线粒体动力学平衡，从而改善TBI后认知障碍。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员使用Aging, Dementia and TBI Study项目（http://aging.brain-map.org/）107例样本，并利用GEO、GTEx等公共数据库，开展单细胞RNA测序（scRNA-seq，约95,000个脑细胞）、空间转录组（4只小鼠约20,000个spots）、RNA-seq、免疫共沉淀-液相色谱串联质谱（IP-LC/MS）、RIP-seq/RIP-qPCR等分析。动物实验采用C57BL/6J、Usp18^flox/flox/Thy1-Cre条件敲除小鼠及AAV9 hSyn介导海马过表达，建立weight-drop TBI模型；体外采用HT22细胞机械拉伸损伤模型。还使用透射电镜、MitoTracker、MitoSOX、JC-1、流式ROS、Co-IP、GST pull-down、CHX chase、泛素突变体及行为学测试等。

研究结果

3.1 鉴定神经元来源USP18为TBI相关重要因子（Identification of neuron-derived USP18 as a vital factor involved in TBI）。研究人员分析107例TBI患者资料，发现海马基因表达模式不同于其他脑区，差异基因富集于泛素介导蛋白水解。GEO数据集分析显示Usp18改变最显著；约95,000个脑细胞scRNA-seq显示神经元Usp18在TBI后逐渐下降，第3天最低；空间转录组显示TBI后海马和皮质神经元富集降低。小鼠TBI后USP18蛋白在急性期第3天损伤侧脑组织显著降低，海马降低明显而皮质不明显；免疫荧光显示USP18主要定位于NeuN+神经元，与GFAP+星形胶质细胞和IBA1+小胶质细胞共定位少。HT22拉伸损伤后USP18逐渐降低。结论：神经元来源USP18在TBI急性期下降，可能参与脑损伤发生。

3.2 恢复神经元USP18表达抑制神经元凋亡并改善TBI后学习记忆恢复。研究人员用hSyn启动子AAV-Usp18实现海马神经元过表达。TUNEL显示TBI后海马TUNEL+神经元增加，USP18过表达抑制凋亡；MAP2免疫荧光显示TBI降低海马MAP2，USP18过表达恢复；免疫印迹显示USP18过表达逆转BCL-2降低及BAX和cleaved caspase-3升高。行为学显示，TBI后新物体识别和Y迷宫受损，AAV-Usp18改善新物体偏好和自发交替率。体外稳定过表达USP18的HT22细胞在拉伸后，calcein-AM/PI、TUNEL、凋亡蛋白和流式检测均显示凋亡减少。结论：恢复神经元USP18表达可抑制凋亡并改善TBI后学习记忆。

3.3 USP18抑制ROS产生并逆转线粒体功能障碍。RNA-seq比较TBI后3天同侧海马，PCA可区分TBI与sham、AAV-Usp18与AAV-null。GO富集显示代谢调节和线粒体组分，尤其正向调节线粒体融合，I型干扰素负调节亦富集。透射电镜显示TBI后神经元线粒体肿胀、破裂、嵴不连续或缺失，USP18过表达减少嵴缺陷和肿胀。公共数据库标记显示USP18过表达抑制分裂相关Fis1、Dnm1、Mff，促进融合相关Opa1、Mfn2、Ppargc1。免疫印迹显示USP18恢复OPA1和MFN2，抑制DRP1及p-Drp1^Ser616，增加TIM23和TOMM20。体外MitoTracker显示USP18恢复线粒体形态；MitoSOX、JC-1和流式ROS显示USP18降低线粒体超氧化物、恢复MMP并抑制ROS。结论：USP18抑制ROS产生并逆转线粒体功能障碍。

3.4 神经元特异性USP18敲除加重TBI后脑损伤。研究人员生成Usp18^flox/flox/Thy1-Cre+（Usp18^cKO）小鼠，确认海马USP18降低。MRI和脑大体显示Usp18^cKO小鼠TBI后损伤体积和表面积增加；H&E显示海马结构紊乱、炎性细胞浸润、细胞皱缩和染色质凝集更严重；Nissl染色显示CA1等区域Nissl体减少更严重；Golgi-Cox Sholl分析显示TBI后Usp18^cKO峰左移，轴突和树突复杂性受损；透射电镜显示Usp18敲除导致更严重嵴丢失。结论：USP18缺失加重TBI后神经元线粒体损伤。

3.5 USP18直接结合DDX5并维持其神经元稳定性。研究人员在HT22拉伸12 h和TBI小鼠海马中行抗USP18免疫共沉淀联合LC-MS/MS，HT22中鉴定522个互作蛋白，海马中鉴定1643个，共同互作蛋白富集于糖脂代谢、转录因子和RNA调控通路。Top10重叠底物中DDX5可维持MMP、ROS平衡和嵴稳定性。内源互作在海马和HT22中得到验证，外源Flag-USP18/Myc-DDX5在HEK293T中得到验证，GST pull-down证实纯化蛋白直接结合，免疫荧光显示二者主要共定位于HT22胞质。USP18过表达增加海马DDX5蛋白而不改变其mRNA；CHX chase显示USP18过表达延长DDX5半衰期，沉默则缩短。结论：USP18直接结合DDX5并阻止其降解。

3.6 USP18通过催化氨基酸C61在K470位去泛素化DDX5改善线粒体功能。MG132处理下，USP18过表达降低DDX5泛素化，敲低则增加；HA-K48或K63泛素突变体显示USP18特异性减少K48连接DDX5泛素化。C61为USP18催化残基且跨物种保守；USP18 WT而非C61S可延长DDX5半衰期并降低泛素化。数据库和文献确定K451和K470，其中K470位于HELICc结构域、严格保守且神经系统中高泛素化。DDX5 K470R突变体不被USP18稳定，泛素化低且不被USP18进一步降低；K470R延长DDX5半衰期。HT22中K470R抑制拉伸后OPA1/MFN2/BCL-2降低和BAX/cleaved caspase-3增加，改善MMP和凋亡；若DDX5为K470R，进一步过表达USP18不能改善线粒体功能和抑制凋亡。ISG15在TBI后升高，但DDX5无明显ISGylation，提示USP18稳定DDX5归因于去泛素化。结论：USP18通过C61在K470位去泛素化DDX5以改善线粒体功能。

3.7 USP18通过促进DDX5介导的Opa1稳定性调控神经元线粒体融合。RNA-seq和LC-MS/MS整合显示RNA稳定性通路富集，LC-MS/MS中RNA调节蛋白仅DDX5在TBI后显著降低。免疫荧光显示DDX5主要位于核内并散在胞质，拉伸后USP18和DDX5胞质水平下降，USP18增加胞质DDX5；核质分离显示损伤后胞质DDX5降低，USP18主要升高胞质水平，核内无明显变化。RIP-seq鉴定8219个DDX5可靠结合基因，与AAV-Usp18 vs null上调DEG和线粒体基因交集得Tomm70a、Src、Ppargc1a、Opa1、Tomm20。RNA-seq与RIP-seq显示DDX5结合Opa1 mRNA峰与USP18过表达上调Opa1峰在外显子1–6高度重合。RIP-qPCR和琼脂糖凝胶验证DDX5富集Opa1；RNA FISH联合免疫荧光显示Opa1 mRNA与DDX5胞质点状共定位。引物分析显示DDX5与5′-UTR和CDS显著互作，而非3′-UTR。GTEx人海马中DDX5与OPA1表达强相关，TBI后相关性增加。DDX5敲除RNA-seq显示Mfn1、Mfn2、Opa1降低，Dnm1l、Fis1增加；HT22过表达DDX5增加Opa1表达；mRNA稳定性显示DDX5敲低将Opa1 mRNA半衰期从4.29 h降至2.16 h。USP18恢复增加拉伸后OPA1，而DDX5敲低降低OPA1且外源USP18不能挽救；MitoTracker显示USP18过表达或缺失不能逆转DDX5敲低致线粒体形态损伤。原代海马神经元中，USP18缺失加重拉伸后OPA1降低，DDX5过表达无论USP18有无均可挽救OPA1、线粒体形态和MMP。结论：USP18通过DDX5依赖方式稳定Opa1 mRNA，改善线粒体形态功能。

3.8 神经元特异性USP18过表达改善已建立TBI，DDX5抑制脑损伤不依赖USP18存在与否。在TBI前10天注射AAV-null、AAV-Usp18或AAV-Ddx5，使表达在TBI后3–4天达峰。MRI显示TBI后损伤体积增加，USP18或DDX5过表达降低损伤体积；Usp18^cKO中过表达DDX5不进一步增加损伤体积。Nissl显示USP18和DDX5减轻胞质空泡化和Nissl体丢失，尤其CA1；Usp18^cKO+DDX5不差于Usp18^f/f+DDX5。Golgi-Cox Sholl显示DDX5过表达使Usp18^cKO峰右移。透射电镜显示DDX5过表达挽救Usp18^cKO TBI后线粒体形态和嵴丰度。Barnes迷宫、旷场、新物体识别和Y迷宫显示，USP18或DDX5过表达改善认知和焦虑样行为；Usp18^cKO+DDX5达到类似效果。结论：USP18通过调节DDX5对TBI提供治疗保护。

讨论部分指出，TBI引发继发性神经退行事件，海马神经元损伤是创伤后认知障碍的核心病理基础，但内源性保护机制尤其去泛素化酶维持蛋白稳态的作用尚未充分探索。研究人员观察到TBI后海马神经元USP18显著下调；神经元特异性敲除加重凋亡，过表达通过保持线粒体动力学抑制凋亡。LC-MS/MS、RNA-seq和RIP-seq鉴定USP18–DDX5–OPA1轴。机制为USP18通过活性位点C61去除DDX5 K470的K48连接多泛素链，增加DDX5稳定性；稳定DDX5促进Opa1 mRNA转录后稳定，改善线粒体功能并抑制凋亡。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）是细胞主要蛋白降解途径，TBI继发损伤涉及USP30、USP4、PSMD14等，本研究发现TBI伴认知障碍者泛素-蛋白酶体通路富集。USP18具有神经保护作用，神经元特异性AAV-Usp18递送具有治疗潜力。USP18功能依赖底物和病理情境，本研究用LC-MS/MS鉴定DDX5为关键底物。K48链主要介导蛋白降解，USP18去除DDX5 K470 K48链促稳定；USP18与DDX5互作主要在胞质，调节特定mRNA稳定性，扩展了DDX5功能。DDX5是多功能RNA解旋酶，参与转录、剪接和核糖体生成；在糖尿病心肌病中调节CaMKIIδ剪接，并调节核编码线粒体蛋白DNAJC11和NDUFS8，维持MMP、ROS平衡和嵴完整性。本研究发现胞质DDX5直接结合并稳定Opa1 mRNA，驱动OPA1表达。OPA1是线粒体内膜融合和嵴重塑主要介导者，不足可触发线粒体碎片化和神经元凋亡。DDX5缺失相关代谢表型如琥珀酸降低和线粒体功能障碍与本研究间接一致。USP18通过去泛素化稳定DDX5增加OPA1；TBI下OPA1可能短暂内源代偿但不足。外源USP18通过上调海马神经元DDX5发挥保护。DDX5在多种细胞表达但对正常组织非必需，适合作为药物靶点；直接靶向OPA1存在系统或脱靶效应，靶向USP18更特异。DDX5经典为核RNA解旋酶，但胞质功能证据增加；UniProt注释成熟DDX5位于胞质和核，核质分离显示损伤诱导DDX5降低和USP18介导升高主要在胞质，核池无显著变化。机制上DDX5有NLS和NES，应激下核质穿梭已有报道；研究人员推测TBI应激可能触发DDX5核质转位，但USP18介导去泛素化可能通过阻止蛋白酶体降解稳定胞质DDX5，而非直接促核输出。当前数据不能区分，未来需研究。局限性包括：神经元拉伸模型不能完全复现真实TBI复杂微环境和异质性；单细胞体外机械加载模型不能完全再现神经元-胶质互作、炎性浸润、缺血/缺氧和机械波非均匀传播；USP18也是ISG15特异性蛋白酶，其deISGylation在TBI后是否神经保护待探索；DDX5结合Opa1 mRNA具体基序和翻译效率未深究；人类数据集主要为老年个体，小鼠为年轻成年，年龄差异可能影响反应幅度或动力学，需老年动物或年龄分层队列。研究结论翻译：研究人员鉴定了一种由USP18促进的机制，该机制在TBI中通过DDX5–OPA1轴介导线粒体动力学稳态，抑制神经元凋亡并改善小鼠认知功能，提示USP18激活或腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）介导的Usp18递送代表TBI的潜在治疗策略。