模拟儿童期进行性假性类风湿性关节炎：CCN6基因敲除绵羊的疾病进展及软骨病理变化

《Osteoarthritis and Cartilage》：Modeling Progressive Pseudorheumatoid Arthropathy of Childhood: Disease Progression and Cartilage Pathology in CCN6 Knockout Sheep

　　

摘要

目的

儿童进行性假性类风湿性关节病（PPAC），也称为进行性假性类风湿性发育不良（PPRD），是一种常染色体隐性遗传病，由细胞通讯网络因子6（CCN6，亦称WISP3）的功能丧失突变引起。PPAC患者在出生时无症状，但在儿童期会发展为多关节关节病，通常在30岁之前需要进行多次关节置换手术。目前，尚无治疗方法能够预防或延缓PPAC的进展。此外，由于缺乏症状前患者的组织样本以及Ccn6敲除（KO）小鼠模型的缺乏，CCN6的功能丧失如何影响关节发育或稳态仍不清楚。

方法

研究人员生成了CCN6-KO羊，期望这种体型更大、寿命更长的动物能更好地模拟人类PPAC的发病过程。

结果

KO羊在幼年时期就出现了关节疾病的临床症状，并且这些症状随着年龄增长而恶化。组织学检查显示其软骨损伤较为严重。此外，KO羊的软骨在生物力学、生物化学和转录组学方面与野生型（WT）存在差异；KO羊的软骨具有与PPAC患者来源的多能干细胞系生成的软骨相似的转录组特征。

结论

这些数据表明，“CCN6-KO羊”再现了PPAC的临床、组织学和分子特征，可以用于阐明疾病机制并测试治疗方法。

引言

儿童进行性假性类风湿性关节病（PPAC），也称为进行性假性类风湿性发育不良（PPRD），是一种罕见的常染色体隐性遗传病，由细胞通讯网络因子6（CCN6，亦称Wnt1-诱导信号蛋白3WISP3）的功能丧失突变引起。[1]，[2]患者会在3-8岁之间出现进行性多关节疾病症状。[1]，[3]关节肿大、僵硬且疼痛，伴有疲劳和步态异常，常导致误诊为幼年类风湿性关节炎（JRA）；然而，PPAC缺乏JRA的特征性炎症表现，如滑膜炎、红细胞沉降率升高或C反应蛋白升高，这解释了为什么免疫抑制剂既不能缓解症状也不能减缓疾病进展。[1]，[2]关节退化在整个青少年期持续，常常需要在年轻成年期进行髋关节和膝关节置换手术。[4]，[5]置换手术中切除的组织形态类似于晚期骨关节炎（OA），包括软骨细胞克隆、骨赘、纤维软骨、软骨下骨囊肿和软骨硬化。[1]，[2]

CCN6的功能尚不明确。CCN蛋白家族的其他成员已被证明是分泌型细胞外基质（ECM）相关信号蛋白，能够调节多种细胞功能，包括细胞粘附、迁移、增殖和分化。[6]，[7]出于伦理原因，目前只能从PPAC患者进行关节置换手术时收集其晚期关节组织。虽然生成了两株Ccn6敲除（KO）小鼠，但它们均未表现出骨骼疾病症状。[8]，[9]在斑马鱼和癌细胞系中过表达CCN6会改变骨形态生成蛋白（BMP）和WNT信号通路，[10]，[11]，[12]但这些观察结果对PPAC患者的相关性尚不清楚。我们将PPAC患者的诱导多能干细胞（iPSCs）分化为软骨组织，这些组织在组织学和转录组学上与同基因型对照组有所不同，但这些差异在体内的实际意义仍不清楚。[13]

为了研究CCN6在体内的作用，研究人员生成了Rambouillet羊（Ovis aries）的KO品系。与小鼠相比，羊的关节和关节软骨在大小、细胞构成和组织结构上更接近人类。[14]，[15]，[16]此前已有使用羊进行基因编辑来模拟另一种遗传性骨骼疾病——低磷酸酶血症的研究。[17]，[18]本文报告了CCN6-KO羊的临床和分子特征，结果表明KO羊再现了PPAC患者的表型，有助于了解CCN6缺失如何导致软骨损伤。

章节片段

CCN6敲除羊的 generation

所有动物实验均遵循当地、州级和联邦法规，并在德克萨斯A&M大学（TAMU）经过批准的IACUC协议下进行。如前所述，[17]使用CRISPR-Cas9技术将功能丧失（LOF）突变引入Rambouillet羊（Ovis aries）的受精卵中，目标基因是CCN6的外显子2（图S1A，C）。第一组胚胎接受了Cas9-2NLS蛋白（Synthego）和gRNA的注射，而第二组胚胎还接受了同源导向的

CCN6敲除羊的 generation

为了建立PPAC的大型动物模型，按照之前描述的方法对Rambouillet羊的胚胎进行了CRISPR-Cas9基因编辑。[17>Ovis aries Rambouillet的CCN6蛋白与人类的同源蛋白有84%的序列相同性和90%的相似性，高于小鼠或斑马鱼。[33]由于许多PPAC患者的致病突变发生在第二个编码外显子上，我们选择了一种引导RNA（gRNA）来靶向羊的相应外显子（图1A，B）。Cas9蛋白和gRNA

讨论

CRediT作者贡献声明

概念构思、监督和资金筹集：April M. Craft、Matthew L. Warman、Larry J. Suva。CRISPR gRNA和修复模板设计：Charles R. Long、Matthew L. Warman。胚胎显微注射（CRISPR-Cas9/gRNA）和植入：Jane H. Pryor、Charles R. Long。动物饲养：Raine Lunde、Shannon Huggins、Dana Gaddy。临床检查与解读：Caterina J. Silveira。组织采集：Cole Dahlstrom、Raine Lunde、Shannon Huggins、Dana Gaddy、Larry J. Suva。RNA

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

利益冲突

致谢

该项目得到了NIAMS（R56-AR084685（A.M.C.、L.J.S.和M.L.W.）、R01AR081393（M.B.A）和T32OD011083（C.J.S.）的支持。我们感谢哈佛医学院的BPF基因组核心设施（RRID: SCR_007175）和肌肉骨骼研究中心（P30 AR075042）提供的专业支持。本文献给Mark Westhusin博士的回忆，他始终如一的鼓励激励我们追求卓越并在科学道路上找到乐趣。Dr. Westhusin的

Nereida J. Ramirez|Catrina J. Silveira|Raine Lunde-Young|Shannon Huggins|Jacob J. Giering|Dev R. Mehrotra|Henry E. Brisebois|Giulia Montagna|Kirby M. Sherman|Alyssa Falck|Cole B. Dahlstrom|Mark E. Westhusin|Jane H. Pryor|Michael B. Albro|Dana Gaddy|Charles R. Long|Matthew L. Warman|Larry J. Suva|April M. Craft

波士顿儿童医院骨科外科，马萨诸塞州波士顿