《The FASEB Journal》：Structural Snapshots of F1-ATPase Catalysis in Drug Resistant Acinetobacter baumannii Reveal Novel Therapeutic Targets
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革兰氏阴性菌鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是世界上最关键的优先病原体之一，其已发展出多种防御机制，包括由质子动力势（proton-motive force, pmf）或ATP驱动的药物外排泵的上调表达。作为一种非发酵菌，该病原体
革兰氏阴性菌鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是世界上最关键的优先病原体之一，其已发展出多种防御机制，包括由质子动力势（proton-motive force, pmf）或ATP驱动的药物外排泵的上调表达。作为一种非发酵菌，该病原体依赖氧化磷酸化途径获取能量，其中F-ATP合酶（F-ATP synthase）由F?-ATP酶（F?-ATPase，α?:β?:γ:ε）和F?结构域（F?-domain，a:b?:c??）组成，催化ATP的合成，ATP是细胞的生命货币。研究人员在此报道了ATP合成过程中捕获的F?-ATP酶冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）结构，揭示了α?:β?催化头内的协同构象变化，这些变化触发ε亚基的结构转变以及γ:ε中央柄的扭转，并与自发性ATP形成相耦合。分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟验证并扩展了旋转机制所依赖的结构重排集合。所解析的ε亚基中间态揭示了其作为分子齿轮（molecular gear）的作用，在调控ATP合成的同时抑制ATP水解，这对病原体防止ATP浪费至关重要。这些结构快照鉴定了新型治疗靶点，并为合理设计选择性抑制剂铺平了道路。
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一、研究背景与科学问题
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）被世界卫生组织列为全球十大病原体之一，也是耐药性最强的革兰氏阴性菌之一。该病原体已对几乎所有抗生素产生耐药性，其耐药机制包括表达中和药物或修饰药物靶点的酶、改变细胞壁通透性、上调药物外排泵以及利用Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统。其中，外排泵和分泌系统是导致鲍曼不动杆菌耐药性的主要因素。大多数分泌系统由ATP驱动，而外排泵则由ATP或质子动力势（pmf）驱动，这两种能量形式均由氧化磷酸化（OXPHOS）途径产生。F?F?-ATP合酶（F-ATP合酶）是鲍曼不动杆菌氧化磷酸化途径的核心组分，催化ADP+P?向ATP的转化。作为一种非发酵菌，鲍曼不动杆菌大部分ATP来源于氧化磷酸化，这使得该途径及其酶成为极具吸引力的药物靶点空间。
鲍曼不动杆菌F-ATP合酶（α?:β?:γ:δ:ε:a:b:c??）在亚基总数和氨基酸组成上与人类线粒体对应物（α?:β?:γ:δ:ε:IF?:a:b:c?:e:f:g:ATP8:j:k:d:F?:OSCP）存在显著的结构差异，这一特性可用于最大限度地减少宿主毒性并提高靶点特异性。可溶性的鲍曼不动杆菌F?-ATP酶（α?:β?:γ:ε）包含三个交替排列的αβ亚基对，其界面处存在催化和核苷酸结合位点，以及中央柄亚基对γ-ε。后者将F?结构域亚基a-c??介导的质子转位与α?:β?区域中的ATP合成相连接。鲍曼不动杆菌F?F?-ATP合酶和F?-ATP酶表现出较低的ATP水解活性以防止能量浪费，从而控制pmf以及参与药物摄取和外排的泵的效率。由于鲍曼不动杆菌F?F?-ATP合酶是双功能催化剂，它需要明确的调控元件来根据代谢需求刺激或抑制ATP合成或水解。
此前，ε亚基C末端结构域（εCTD）如何从伸展形式（ε?）转变为紧凑形式（εc）的过渡机制一直未被解析。εCTD最终转化为两个位于εNTD上方的螺旋，这一转化必须与伸展螺旋ε91–125的移位以及位于αDP:βTP界面的ε129–139的移位并行发生。此外，ε亚基在ATP合成和水解双重调控中的具体分子机制，以及底物诱导的ATP形成的能量来源等关键科学问题仍有待阐明。
二、研究内容与主要结论
研究人员将纯化的重组鲍曼不动杆菌F?-ATP酶与12 μM MgADP和无机磷酸盐（P?）共孵育，模拟ATP合成条件，并通过冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了ATP合成过程中F?-ATP酶的六种构象状态。这些构象基于εCTD的构象可分为三大类：伸展εCTD（C1a和C1b，分辨率分别为3.13 ?和3.04 ?）、部分伸展εCTD（C2a和C2b，分辨率分别为3.05 ?和2.95 ?）以及εCTD的外侧过渡态1和2（C3a和C3b，分辨率分别为3.08 ?和2.88 ?）。这是首次在野生型鲍曼不动杆菌F?-ATP酶中观察到ε亚基的多种构象。
ATP合成测定显示，纯化的鲍曼不动杆菌F?-ATP酶在MgADP+P?存在下可重复性地产生自发性ATP形成，且随时间推移因形成的ATP被缓慢裂解而减少，证实该酶在ATP合成方向上具有活性。在C1a构象中，βDP亚基结合MgADP·P?，而在C1b构象中仅结合P?。C1a到C1b的转变揭示了βDP C末端（包括关键的377DIIAILGMDE386环，与大肠杆菌DELSEED基序同源）向外摆动24°，同时P-loop向外摆动26°，β-catch环与γ-tether残基之间的相互作用减弱，这可能有助于Mg-ADP的释放。尽管βDP发生了24°的大幅度运动，γ亚基在CTD中最多仅扭转6°。重要的是，从C1a到C1b的βDP C末端大尺度运动破坏了C1状态下的αDP:βDP:γ界面，为εCTD从伸展形式向紧凑形式转变提供了空间。C1a和C1b的比较首次揭示了εCTD从伸展形式向紧凑形式过渡的"起始状态"，起始于鲍曼不动杆菌特异的钩状C末端ε134–139和短α2螺旋（ε129–134）的重新定向。
C1到C2a的转变揭示了εCTD从伸展α-螺旋（ε91–125）转变为由ε91–98、ε102–108和ε120–131残基形成的三个较小螺旋。这种转化伴随着ε91–108在αE:βDP界面的移位以及ε120–139在αDP:βTP界面的移位。C2a到C2b的转变中，εCTD从三螺旋构型转变为双螺旋构型，其中ε91–98和ε102–108螺旋融合为跨越ε90–104的单一螺旋，后者与紧凑形式最终α1螺旋相似。这一重排过程由εNTD的14°扭转所支持。为促进这些转变，β-catch环（24°）和C1b"紧密"构象中βTP的C末端向外移动30°，同时伴随βTP螺旋T182-S195的展开，该螺旋靠近P-loop。这些协同的向外旋转为εCTD的向下和向外运动打开了通路。此转变还包括中央柄沿顺时针（ATP合成）方向扭转19°，而γ亚基的N和C末端结构域不发生旋转。
C3a和C3b构象代表εCTD已从αβ对脱离的外侧过渡态。在C3a中，ε2–106残基被解析，其中ε90–106形成与γ的Rossman折叠相邻的连续螺旋。在C3b中，仅εNTD（ε2–80）能被建模到冷冻电镜图中。从C2b到C3a的转变中，βDP的下部结构域向内移动30°进入其半闭合状态，伴随β182–187螺旋的重新形成，γ-foot结构域摆动约10 ?并使εNTD扭转13°。C3a到C3b的转变伴随着αDP C末端向内移动25°，闭合αβDP底部结构域，并改变αβDP活性位点的几何结构，其中βR181和αR377与MgATP的相互作用在C3b中比C3a中更紧密。值得注意的是，βDP位点的核苷酸占用从C2a-b中的ADP结合转变为C3a-b中的MgATP结合，证实ATP在一个催化位点中形成。
三、关键技术与方法
研究人员采用了以下主要关键技术方法：冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析技术，使用FEI Titan 300 kV透射电子显微镜配备Gatan K3直接电子探测器采集数据，共收集5093部电影，通过cryoSPARC V4.6.0进行图像处理，最终获得891,625个颗粒，经多轮分类后得到562,934个高质量颗粒用于三维重构；靶向分子动力学（targeted molecular dynamics, TMD）模拟，使用基于RMSD的偏置势，在Gromacs 2018.8和Plumed 2.6.4中执行，模拟温度310 K、压力1 bar，采用CHARMM36m力场，系统包含约130,000个TIP3P水分子，模拟时长从200至600 ns不等，偏置速率约为每200 ns 5 ? RMSD；以及基于MDAnalysis和DSSP的结构分析，用于量化βDP C末端相对于柄的角运动、εCTD相对于γ/ε柄的扭转角度以及二级结构变化。模拟工作在新加坡国家超级计算中心（NSCC）完成。
四、研究结果
3.1 冷冻电镜解析MgADP和P?孵育的鲍曼不动杆菌F?-ATP酶
研究人员将纯化的重组鲍曼不动杆菌F?-ATP酶与12 μM MgADP+P?共孵育后进行冷冻电镜研究，共解析出六种构象状态，基于εCTD构象分为三大类：伸展εCTD（C1a和C1b）、部分伸展εCTD（C2a和C2b）以及外侧过渡态（C3a和C3b）。ATP合成测定证实该酶在ATP合成方向上具有活性。C1a中βDP结合MgADP·P?，而C1b中仅结合P?，这种核苷酸占用模式证实了观察到的自发性ATP形成。
3.2 βDP C末端的外摆运动
通过C1a和C1b构象的比较发现，βDP的C末端（包括关键的377DIIAILGMDE386环）向外摆动24°，P-loop向外摆动26°，β-catch环与γ-tether之间的相互作用减弱。为平衡这一摆动运动，中央柄的foot结构域向βDP运动的相反方向轻微移动。尽管βDP发生24°的大幅度运动，γ亚基最多仅扭转6°。TMD模拟证实了这一24°的外摆运动，并显示βDP环（377–386残基）与ε之间的相互作用丧失仅在超过60%的模拟时间后才发生，表明C1a状态下两亚基之间存在强相互作用。
3.3 εCTD螺旋形成的一-三-二转变
C1到C2a的转变揭示了εCTD从伸展α-螺旋转变为三个较小螺旋，C2a到C2b的转变中三螺旋融合为双螺旋。这些转变伴随着β-catch环和βTP C末端的外移、βTP螺旋T182-S195的展开以及中央柄沿顺时针方向扭转19°。TMD模拟证实了ε从伸展螺旋向较小螺旋的逐步转变，模拟中出现的115–117残基间小段无结构区域提示该区域具有解折叠倾向。
3.4 为αβDP底部的螺旋转化和移位提供空间
C3a和C3b代表εCTD已脱离αβ对的外侧过渡态。C2b到C3a的转变中，βDP下部结构域向内移动30°进入半闭合状态，γ-foot结构域摆动约10 ?并使εNTD扭转13°。C3a到C3b的转变伴随着αDP C末端向内移动25°，闭合αβDP底部结构域，并改变活性位点几何结构。βDP位点的核苷酸占用从ADP转变为MgATP，证实ATP在一个催化位点中形成。600 ns TMD模拟显示εC末端结构域绕γ/ε柄轴发生了约55°的渐进扭转。
五、讨论与结论
研究人员提出了εCTD作为"齿轮箱"的调控模型：C1a-b构象代表的伸展εCTD为"低档"模式，抑制ATP水解、保存ATP并维持pmf和ATP/ADP稳态；C2a-b和C3a构象代表"混合档"模式，酶响应细胞环境变化并进行结构改变；C3b构象代表"高档"模式，在营养条件充足、pmf足以持续驱动ATP合成时激活最大催化能力。
关于底物诱导的ATP形成的能量来源，研究人员指出，在水溶液中ATP合成所需能量为31.5 kJ/mol，而在紧密结合口袋中该能量为?8.4 kJ/mol，这使得ATP在紧密口袋中的形成是自发的。pmf提供打开紧密界面、释放已结合ATP并摄取ADP和P?以继续旋转ATP合成的能量。因此，观察到的ATP形成能量来自驱动催化界面结构重排的力，即中央柄重构。ADP结合βDP后触发εCTD重排，中央柄协同扭转，最终诱导βDP收紧形成ATP。这一发现揭示了ATP合酶的新范式：底物ADP和P?的结合诱导中央柄和催化位点之间的协同变化，自发形成ATP并启动旋转ATP合成。
在治疗靶点方面，C3a过渡态首次揭示了εCTD从γ柄逐步释放的过程，螺旋2先于螺旋1退出。通过分子胶（molecular glue）将εCTD两个螺旋锚定到γ的Rossman折叠上，可阻断ATP合成的关键过渡步骤。由于鲍曼不动杆菌γ-ε表位的氨基酸组成与人类对应物存在显著差异，此类分子胶的毒性效应可被避免。这些中间态结构为新型靶点和先导化合物鉴定提供了宝贵的结构快照。
