2型糖尿病伴周围神经病变患者循环自然杀伤细胞频率改变且功能与促血管生成活性受损

《The FASEB Journal》：Circulating Natural Killer Cells in Patients With Type 2 Diabetes and Peripheral Neuropathy Are Altered in Their Frequency and Exhibit Impaired Functions and Angiogenic Activities

　　

摘要专业翻译 2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）合并严重肢体威胁性缺血（critical limb-threatening ischemia, CLTI）——一种与截肢和高死亡率相关的严重血管并发症——的患者表现为慢性炎症和内皮功能障碍。研究人员此前报道晚期CLTI患者自然杀伤（natural killer, NK）细胞频率增加；然而，在周围神经病变（peripheral neuropathy）患者中——该病变常先于伴或不伴远端大血管病变的糖尿病足病变出现——NK细胞改变是否已经存在仍不清楚。研究人员开展了一项观察性初步研究（observational pilot study），通过流式细胞术（flow cytometry）评估177名受试者的循环NK细胞频率，并通过ELISA检测血浆炎性细胞因子谱，受试者分为五组：健康对照（healthy controls, HC, n?=?25）；无神经血管并发症的T2DM（D, n?=?26）；无足部病变的非大血管病变神经病变型T2DM（N, n?=?40）；伴下肢溃疡/病变/骨髓炎的非大血管病变神经病变型T2DM（N1, n?=?42）；以及接受血运重建的伴溃疡/病变/骨髓炎的大血管病变神经病变型T2DM（NV, n?=?44）。在一个独立队列中评估了非大血管病变神经病变型T2DM患者（n?=?22）与健康对照（n?=?23）的NK细胞亚群频率。进一步对NK细胞进行了脱颗粒能力、分泌组（secretome）组成及促血管生成活性的体外（in vitro）和体内（in vivo, Hirudo verbana）表征。与非大血管病变神经病变型T2DM患者相比，对照组NK细胞频率显著升高，并伴有与NK细胞活化和功能相关的可溶性介质血浆水平升高，包括TNF-α、IL-12p70、MCP-1和IL-4。这些患者的NK细胞表现出脱颗粒功能受损以及体外和体内血管生成能力降低。其分泌组特征为促血管生成因子释放减少，而参与单核细胞/巨噬细胞募集的介质分泌增加，导致体内巨噬细胞募集增强。若在更大规模队列中得到证实，循环NK细胞频率升高和功能受损可能作为T2DM外周血管并发症的新型治疗靶点和预后生物标志物。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

糖尿病是全球范围内快速增长的重大代谢性疾病。2024年数据显示，20–79岁成年人中糖尿病患病率已达11.11%，预计到2050年将升至近13%。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）患者常合并多种心血管并发症，其中周围神经病变与远端外周动脉疾病（peripheral artery disease, PAD）的共存会显著增加足部溃疡、肢体丧失和死亡的风险。神经病变影响约50%的T2DM患者，导致保护性感觉丧失、足部畸形和自主神经功能障碍，从而 predispose 溃疡形成；而严重PAD（即严重肢体威胁性缺血，critical limb-threatening ischemia, CLTI）则损害伤口愈合，增加感染和截肢风险。

慢性炎症是糖尿病血管并发症的关键宿主特征，表现为TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6等促炎细胞因子循环水平升高。自然杀伤（natural killer, NK）细胞作为1型固有淋巴样细胞（type-1 innate lymphoid cells, ILCs）的一个亚群，具有显著的功能可塑性，可在不同微环境中从经典细胞毒功能切换为促修复和促血管生成功能。NK细胞主要分为两个表型亚群：占循环NK细胞90%–95%的CD56^dimCD16⁺亚群具有细胞溶解能力，而占5%–10%的CD56^brightCD16^?亚群主要分泌IFN-γ等细胞因子。此外，在蜕膜中鉴定出第三种CD56^superbrightCD16^? NK细胞亚群（即蜕膜NK细胞，decidual NK, dNK），其具有耐受表型和促血管生成功能，可产生血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、胎盘生长因子（placental growth factor, PlGF）和CXCL8/IL-8。在实体肿瘤等病理环境中，已观察到具有蜕膜样表型（CD56^brightCD16^?CD9⁺CD49a⁺）的促血管生成NK细胞。

然而，在T2DM神经血管并发症背景下，NK细胞的表型和功能数据此前完全缺乏。研究人员开展这项观察性初步研究，旨在检验以下假说：循环NK细胞频率和功能的改变与T2DM周围神经病变相关，并可能通过可溶性介质参与晚期糖尿病外周血管疾病血管并发症的进展。该研究对于识别PAD和CLTI的预后生物标志物具有重要的临床意义——这仍是一个未满足的临床需求。

二、主要技术方法

研究人员在意大利特雷维索Ca′ Foncello医院代谢科门诊连续招募T2DM患者，经当地伦理委员会批准开展研究。探索性队列共纳入177名受试者，分为五组：健康对照（HC, n?=?25）、无神经血管并发症的T2DM（D, n?=?26）、无足部病变的非大血管病变神经病变型T2DM（N, n?=?40）、伴溃疡/病变/骨髓炎的非大血管病变神经病变型T2DM（N1, n?=?42）以及接受血运重建的大血管病变神经病变型T2DM（NV, n?=?44）。功能表征采用独立队列（神经病变型T2DM n?=?22，健康对照 n?=?23）。

关键技术方法包括：采用多色流式细胞术（flow cytometry）对外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）进行免疫表型分析，鉴定T细胞、B细胞和NK细胞亚群；采用ELISA检测血浆细胞因子谱；通过K562靶细胞共培养进行NK细胞脱颗粒（CD107a）功能测定；利用荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分离NK细胞并制备条件培养基（conditioned media, CM）；采用细胞因子抗体芯片进行NK细胞分泌组分析；通过Matrigel内皮细胞管形成实验和球状体胶原侵袭实验评估体外血管生成能力；利用水蛭（Hirudo verbana）体内模型结合光学显微镜、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、CD31免疫荧光和酸性磷酸酶（acid phosphatase reaction, ACP）染色评估体内血管生成和巨噬细胞募集；采用RT-qPCR检测NK细胞功能相关基因表达。

三、研究结果

3.1 循环NK细胞频率在无足部病变的T2DM伴周围神经病变患者中较健康对照显著升高

研究人员对177名受试者的外周血免疫细胞群体进行了流式细胞术分析。与健康对照相比，无足部病变的糖尿病伴神经病变组（N组）CD56⁺CD16⁺ NK细胞频率显著升高（p?=?0.004）；N1组CD19⁺ B细胞频率显著降低（p?=?0.009）。多变量logistic回归模型在校正年龄、性别、吸烟习惯和BMI后，NK频率升高仍与周围神经病变显著相关（OR?=?1.12, p?=?0.014, AUC?=?0.773）。血浆细胞因子分析显示，糖尿病受试者TNF-α、MCP-1、IL-12p70和IL-4水平均显著高于健康对照，且随神经病变严重程度递增，其中TNF-α是最丰富的可溶性因子。

3.2 神经病变型T2DM患者NK细胞亚群分布和旁分泌活性改变

在独立验证队列中，研究人员对NK细胞亚群进行了详细表征。与对照组相比，神经病变型T2DM患者CD56^dimCD16^? NK细胞亚群显著减少，NKG2D⁺ NK细胞比例增加，CD9⁺蜕膜样NK细胞呈增加趋势。脱颗粒实验显示，神经病变组患者CD107a⁺脱颗粒NK细胞比例显著低于健康对照，且伴有IFN-γ表达降低和免疫细胞耗竭标志物CD96/Tactile及TIM3表达升高。将神经病变患者NK细胞的条件培养基（CM NK–N）作用于内皮细胞，与健康对照NK细胞CM相比，显著损害了HUVEC的毛细血管样管形成能力和球状体胶原侵袭能力，表明循环NK细胞获得了功能障碍性分泌表型。

3.3 神经病变型T2DM患者循环NK细胞分泌组在体内表现出促血管生成活性受损

在水蛭体内模型中，注射健康对照NK细胞CM（CM NK–HC）后可见大的上皮下血管形成；而注射神经病变型T2DM患者NK细胞CM（CM NK–N）则引发显著炎症反应，表现为上皮下和细胞外基质中大量巨噬细胞和粒细胞浸润，大肌内血管数量显著减少。CD31免疫荧光定量证实CM NK–HC注射组CD31表达更高。透射电镜显示，CM NK–HC处理的水蛭内皮细胞呈连续单层，基底板致密，紧密连接完整；而CM NK–N处理的水蛭血管内皮细胞向管腔伸出突起，基底膜松散，血管壁出现开口或细胞间隙。ACP染色定量证实CM NK–N注射组巨噬细胞募集显著增加。

3.4 神经病变型T2DM患者循环NK细胞呈现促炎性分泌组特征

细胞因子抗体芯片分析显示，神经病变型T2DM患者与健康对照的NK细胞CM呈现明显不同的分泌组模式。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示两组间清晰分离。共鉴定出12个差异释放的可溶性因子：6个在神经病变组CM中上调（倍数变化>1.2，其中MIG/CXCL9达到最高倍数变化15.6），6个在对照组中上调（倍数变化

四、讨论与结论

讨论部分指出，该研究首次在T2DM晚期疾病阶段之前调查了NK细胞改变。研究结果表明，循环NK细胞频率增加和功能受损可能构成连接糖尿病神经病变、先天免疫功能障碍和血管疾病（以纵向M?nckeberg内侧钙化为特征）的有害桥梁，为重新定义糖尿病足发病机制的经典三联征提供了统一框架。研究人员提出，慢性炎症环境可能促使NK细胞从效应表型向功能障碍或耗竭状态转变，表现为脱颗粒能力降低和抑制性受体表达增加。功能低下的NK细胞将影响患者对感染的有效应答和组织修复能力，从而加剧糖尿病相关并发症和足部感染并发症。分泌组分析结果与体内血管生成研究一致，表明神经病变相关循环NK细胞的主要损伤涉及血管成熟和复杂血管结构的发育。

研究结论指出，该研究表征了糖尿病神经病变患者循环NK细胞的表型和功能，提供了其脱颗粒能力改变以及对内皮产生有害影响（通过释放可溶性因子）的体内证据。检测T2DM患者外周血中NK细胞频率可作为一种微创方法，为血管病变风险评估提供信息。尽管该研究受限于相对较小的样本量，结果需在更大规模、年龄和性别匹配的队列中验证，但流式细胞术作为一种广泛可用的实验室技术，可在易于获取的外周血临床样本上实施，支持该研究成果快速转化为临床实践的潜力。

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