《Neuropharmacology》：Thyrotropin-releasing hormone increases dorsal premammillary nucleus neuron activity and darting behavior
编辑推荐：
促甲状腺激素释放激素（Thyrotropin-releasing hormone，TRH）是一种三肽神经肽，最初因其通过下丘脑-垂体-甲状腺（hypothalamic-pituitary-thyroid，HPT）轴调节甲状腺功能而被发现。除内分泌功能外，TRH
促甲状腺激素释放激素（Thyrotropin-releasing hormone，TRH）是一种三肽神经肽，最初因其通过下丘脑-垂体-甲状腺（hypothalamic-pituitary-thyroid，HPT）轴调节甲状腺功能而被发现。除内分泌功能外，TRH在中枢神经系统中广泛分布，并被证明可影响觉醒、运动活动、产热和自主神经调节。背侧乳头上核（dorsal premammillary nucleus，PMd）是内侧下丘脑防御系统中的一个关键节点，控制逃逸行为及其强度。然而，调节PMd神经元活动的神经调质机制仍知之甚少。研究人员结合分子、电生理、钙成像和行为学方法，检验了TRH增强PMd神经元活动及输出的假说。研究结果显示，PMd内检测到TRH受体（TRHR）表达，且部分与表达胆囊收缩素（CCK）的神经元共定位。全细胞电流钳记录表明，TRH选择性增加了一部分PMd神经元的放电频率，而时间匹配的载体对照实验中极少出现类似响应。离体钙成像进一步证实，TRH在群体水平上显著增加了PMd神经元的ΔF/F信号，其中219/673个神经元被归类为响应神经元。在体内行为学实验中，下丘脑内（intrahypothalamic，ih）给予TRH显著增加了冲刺（darting）事件次数，而未改变总移动距离、运动回合数、挖掘、探究或冻结行为，同时减少了梳理（grooming）回合数。这些发现将PMd确定为TRH信号传导的一个此前未被表征的功能靶点，并提示肽能调节可影响特定形式的快速下丘脑行为输出。
一、研究背景与科学问题
促甲状腺激素释放激素（Thyrotropin-releasing hormone，TRH）是一种三肽神经肽，最初因其通过下丘脑-垂体-甲状腺（hypothalamic-pituitary-thyroid，HPT）轴调节甲状腺功能而被发现。除经典内分泌功能外，TRH在中枢神经系统中广泛分布，已被证明参与觉醒、运动活动、产热和自主神经调节等多种非内分泌功能。已有研究显示，外侧下丘脑中的TRH信号可通过食欲素/下丘脑分泌素（orexin/hypocretin）神经元促进运动激活，而表达TRH的下丘脑神经元群体可调节运动活动。近年来的解剖学研究进一步发现，外侧下丘脑表达TRH的神经元广泛投射至下丘脑和边缘系统区域，包括背侧乳头上核（dorsal premammillary nucleus，PMd），这为TRH调节PMd活动提供了潜在的解剖通路。
PMd是内侧下丘脑防御系统中的关键节点，通过与导水管周围灰质（periaqueductal gray，PAG）等下位结构的相互作用控制逃逸行为和逃逸强度。已有研究表明，表达胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）的PMd神经元是下丘脑防御回路的重要组成，其活动与逃逸强度、快速运动反应及逃逸行为的习得性增强相关，而非泛化的运动活动。然而，调节PMd神经元活动的神经调质机制仍不清楚。基于此，研究人员提出假说：TRH可能增强PMd神经元活动及行为输出，并开展了多层次的分子、电生理、钙成像和行为学研究加以验证。
二、主要技术方法
研究采用多种关键技术手段。分子水平上，使用RNAscope多重荧光原位杂交（in situ hybridization，ISH）检测PMd内TRH受体（TRHR）mRNA表达及其与CCK阳性神经元的共定位关系。电生理水平上，在急性脑片上对PMd神经元进行全细胞电流钳记录，评估TRH（10 μM）灌流对神经元放电频率的影响，并设置时间匹配的载体对照实验。钙成像方面，通过立体定位注射AAV9-hSyn-GCaMP6s病毒使PMd神经元表达钙指示蛋白，在急性脑片上以10 fps采集时间序列图像，经NoRMCorre运动校正和CNMF算法提取神经元感兴趣区域及钙活动轨迹。行为学方面，采用下丘脑内（intrahypothalamic，ih）给药交叉设计，小鼠分别接受TRH（1 μg）或生理盐水处理，在旷场实验（open field test，OFT）中记录行为，结合姿势分析（YOLO26关键点标记和梯度提升机建模）与速度阈值混合启发式方法识别冲刺（darting）、冻结、梳理、挖掘、探究等行为事件。实验动物为C57BL/6J小鼠，雌雄兼有。
三、研究结果
3.1 PMd神经元表达TRHR
RNAscope原位杂交结果显示，PMd解剖边界内可观察到TRHR mRNA信号，部分与CCK阳性神经元共定位。高倍镜图像进一步显示PMd内存在共定位和独立分布的Trhr与Cck信号。跨动物统计显示，平均39.59%的CCK阳性神经元表达可检测的TRHR信号，37.96%的TRHR阳性细胞为CCK阳性，14.49%的PMd细胞同时表达Cck和Trhr。这表明PMd内存在表达TRHR的神经元亚群，TRH可能选择性作用于特定的PMd神经元群体。
3.2 TRH增加部分PMd神经元放电频率
在急性脑片上进行全细胞电流钳记录，共记录69个PMd神经元，其中18个符合响应分类标准。结果显示，TRH增加了其中9个神经元的放电频率（响应神经元），其余9个无显著变化（非响应神经元）。时间匹配的载体对照实验中，35个记录神经元中仅1个符合响应标准，远低于TRH组。平均放电频率分析显示阶段主效应显著（F(1,33)=4.870，p=0.0342），响应者和非响应者在TRH应用期间放电频率存在差异（p=0.0456），但基线无差异。归一化最大放电频率在响应者中显著高于非响应者（p=0.0085）。静息膜电位、动作电位阈值、峰值幅度、后超极化幅度和时程等电生理特性在两组间无显著差异。兴奋性突触后电位（EPSP）频率无显著变化，表明TRH的效应不通过突触前机制介导。
3.3 TRH诱发PMd神经元钙响应
在表达GCaMP6s的急性PMd脑片上进行离体钙成像。TRH显著增加了所有记录神经元的平均ΔF/F（配对t检验，t(671)=6.166，p<0.0001），按切片平均后同样显著增加（t(6)=3.261，p=0.0224）。在673个记录神经元中，219个被归类为响应神经元，454个为非响应神经元。混合效应模型分析显示阶段、响应组及二者的交互效应均显著。事后比较表明，响应神经元在TRH应用期间ΔF/F显著增加（p<0.0001），而非响应神经元无显著变化（p=0.7912）。响应者和非响应者基线无差异，但TRH暴露期间响应者活动显著高于非响应者（p<0.0001）。
3.4 下丘脑内TRH选择性改变冲刺和梳理行为
在旷场实验中，下丘脑内TRH给药未显著改变总移动距离（p=0.1699）、中央区域停留时间（p=0.5114）或运动回合数（p=0.3530）。然而，TRH显著增加了冲刺事件次数（p=0.0146），而总冲刺时间和总冲刺距离未达显著水平（p=0.0564和p=0.0526）。梳理回合数显著减少（p=0.0323），但总梳理时间无显著变化。挖掘、探究和冻结行为的回合数与持续时间均无显著变化。这表明TRH增加了离散的高速度运动事件频率，而非泛化的运动激活。
四、讨论与结论
本研究表明，TRH在多个分析水平上调节PMd神经元活动和冲刺行为。TRHR在PMd内表达且部分与CCK阳性神经元共定位，提示PMd内存在分子异质性的神经元亚群。电生理和钙成像实验一致显示TRH选择性激活部分PMd神经元，且这种效应并非由突触前机制或记录漂移所致。行为学上，TRH特异性增加冲刺事件次数而不改变总移动距离等常规运动指标，支持TRH对快速运动输出而非泛化运动活动的选择性调节。研究人员指出，冲刺行为与逃逸相关状态相关，PMd通过投射至导水管周围灰质调节逃逸强度，这与观察到的行为表型一致。TRH对梳理行为的影响表现为回合数减少而总时间不变，提示TRH可能改变梳理行为的时间组织而非整体参与程度。
研究局限性包括：旷场实验无明确威胁刺激，不能确定TRH诱导的是否为威胁诱发的逃逸状态；Fluoro-Gold扩散超出PMd边界，不能确定PMd单独是必要或充分的；未进行受体特异性阻断实验；内源性TRH在PMd内的释放来源仍需进一步确认。未来研究可采用投射特异性和细胞类型特异性方法（如化学遗传学或光遗传学抑制）验证PMd活动的必要性，并通过TRHR选择性药理学或遗传学操作提供更直接的受体介导证据。综上所述，本研究证明内侧下丘脑中的TRH信号可诱导冲刺行为，该效应可能部分由PMd中的TRH受体介导，将PMd确定为TRH信号传导的功能靶点，为理解肽能调节如何影响特定形式的快速下丘脑行为输出提供了新见解。
