STEP61通过酪氨酸去磷酸化调控mGluR5表达：介导表面表达下调与溶酶体降解

《Neuropharmacology》：STEP 61 is a regulator of mGluR5 expression

mGluR₅可与STEP61结合。STEP61可降低mGluR₅的总表达水平和表面表达水平。在STEP基因敲除（STEP KO）小鼠中，mGluR₅的表达及酪氨酸磷酸化水平均升高。STEP61通过溶酶体降解途径调控mGluR₅的表达。酪氨酸磷酸化缺失突变体mGluR₅的表达水平降低。

论文解读：STEP61通过酪氨酸去磷酸化调控mGluR₅表达

一、研究背景与问题

代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptors，mGluRs）属于C类G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs），广泛表达于中枢神经系统，参与突触传递与可塑性调控。其中，I组mGluRs包括mGluR₁和mGluR₅，主要位于突触后膜，通过Gq/11激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC），引发胞内Ca²⁺升高及蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活。mGluR₅在海马和皮层高度富集，调节神经元兴奋性及长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）强度，并能调控离子型谷氨酸受体（如NMDA受体亚基GluN1和GluN2B）的表达与功能。mGluR₅的异常表达和信号转导与焦虑、抑郁、成瘾、自闭症、阿尔茨海默病甚至淋巴瘤和黑色素瘤等多种疾病相关，因此mGluR₅表达调控机制具有重要的基础研究意义和药物开发价值。

酪氨酸磷酸化是调节离子型和代谢型谷氨酸受体的关键修饰之一。酪氨酸激酶和磷酸酶之间的平衡维持细胞稳态。mGluR₅的胞内长C末端含有四个酪氨酸残基，其磷酸化状态可影响mGluR₅自身及其他谷氨酸受体的功能，进而改变突触强度与可塑性。然而，以往关于mGluR₅翻译后修饰的研究多集中于丝氨酸/苏氨酸磷酸化，对酪氨酸磷酸化如何调控mGluR₅运输和表达知之甚少。纹状体富集蛋白酪氨酸磷酸酶（striatal-enriched protein tyrosine phosphatase，STEP，又称PTPN5）是脑特异性酪氨酸磷酸酶，其剪接变体STEP61是皮层和海马中唯一表达的STEP形式，含两个跨膜区、两个脯氨酸富集区、激酶相互作用基序（KIM）、激酶特异性序列（KIS）和蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）结构域。STEP61已知可直接结合并去磷酸化NMDA受体和AMPA受体，调节其突触或突触外运输。但STEP61是否直接调控mGluR₅尚不清楚。研究人员前期通过蛋白质组学发现mGluR₅可能是STEP61的结合蛋白，本研究旨在验证这一相互作用并阐明其功能意义。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过免疫共沉淀、免疫金电子显微镜、结构域截断突变、表面生物素化、溶酶体/蛋白酶体抑制、STEP基因敲除（STEP KO）小鼠脑突触膜分析、酪氨酸点突变及共转染实验等技术，系统研究了STEP61对mGluR₅的调控。结果表明：STEP61与mGluR₅在脑组织、原代神经元和异源细胞中直接结合；STEP61主要定位于突触外膜，与mGluR₅的空间分布高度重叠；STEP61的KIM和KIS结构域是结合mGluR₅C末端的关键区域，且其N端增强结合能力；STEP61表达显著降低mGluR₅总蛋白和表面表达，该效应通过溶酶体降解途径实现；在STEP KO小鼠中，mGluR₅蛋白表达和酪氨酸磷酸化水平均升高；mGluR₅C末端四个酪氨酸突变为丙氨酸后，其表面表达下降且不再受STEP61或Fyn的调控。这些发现确立了STEP61通过酪氨酸去磷酸化负调控mGluR₅表面表达和蛋白稳定性的重要机制，为理解mGluR₅相关疾病的病理机制及靶向治疗提供了新视角。

三、主要关键技术方法

研究人员采用多种生化与细胞生物学方法：利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）验证内源及外源蛋白相互作用；通过免疫金电子显微镜（immunogold electron microscopy，EM）分析STEP61和mGluR₅在培养大鼠海马神经元突触的超微结构定位；使用AlphaFold蛋白结构预测指导结构域相互作用分析；通过表面生物素化测定法检测细胞表面mGluR₅水平；应用溶酶体抑制剂（氯喹、NH₄Cl）和蛋白酶体抑制剂（MG-132）鉴定降解途径；从野生型（WT）和STEP KO小鼠（购自Jackson Laboratory）脑中纯化突触浆膜（synaptic plasma membrane，SPM）并检测mGluR₅表达和酪氨酸磷酸化；构建mGluR₅酪氨酸点突变体（Y821A、Y963A、Y1060A、Y1155A、Y1163A及4YAs）并在原代海马神经元和HEK293T细胞中通过免疫荧光定量表面与胞内表达。样本来源包括成年小鼠脑、大鼠原代皮层神经元（DIV 28）和海马神经元（DIV 10-13）以及HEK293T细胞。

四、研究结果

（一）STEP61与mGluR₅相互作用并共同定位于突触外区域

通过抗HA免疫共沉淀，在HEK293T细胞中证实外源HA-STEP61与myc-mGluR₅结合；在成年小鼠脑P2组分和大鼠原代皮层神经元（DIV 28）中，内源性STEP61可免疫沉淀mGluR₅，而mGluR₁几乎不与STEP61共沉淀。免疫金EM显示，STEP61在兴奋性突触存在两个群体：突触外膜附近的膜结合群体和PSD核心区下方的亚突触群体；mGluR₅主要标记在PSD外侧的突触周围膜上，其距突触后膜的距离及距PSD外缘的侧向距离均与突触外STEP61无显著差异，且约80%的STEP61和mGluR₅标记位于距PSD 100 nm以内，表明二者在突触外膜共定位。

（二）STEP61中KIM和KIS结构域及N端对结合mGluR₅至关重要

AlphaFold预测STEP61的KIM和KIS结构域与mGluR₅C末端最后120个氨基酸存在相互作用。实验验证发现，删除PTP结构域不影响STEP61与mGluR₅结合；进一步删除KIS结构域使结合降低30.7%；再删除KIM结构域则结合降低76.4%。天然存在的STEP46亚型（缺少N端两个脯氨酸富集区和两个跨膜区）与mGluR₅的结合仅为STEP61的43%。因此，STEP61的KIS和KIM结构域是结合mGluR₅的主要位点，N端则增强这一相互作用。

（三）STEP61表达降低mGluR₅表达水平

表面生物素化实验显示，在HEK293T细胞中共表达STEP61后，mGluR₅总蛋白降至对照的43.7%，表面表达降至75.9%。在原代海马神经元中，STEP61共表达使mGluR₅表面表达降至对照的67.4%，而共表达Fyn激酶无此效应。这表明STEP61在异源细胞和神经元中均能减少mGluR₅的总表达和表面表达。

（四）STEP61通过溶酶体途径促进mGluR₅降解

在HEK293T细胞中，溶酶体抑制剂氯喹（50 μM）和NH₄Cl（20 mM）处理可完全恢复STEP61引起的mGluR₅总蛋白下降，而蛋白酶体抑制剂MG-132（1 μM）无效，证实STEP61通过溶酶体降解途径降低mGluR₅蛋白水平。

（五）STEP KO小鼠脑中mGluR₅表达及酪氨酸磷酸化增加

从WT和STEP KO成年小鼠脑中纯化SPM后，免疫印迹显示STEP KO脑中mGluR₅总蛋白水平较WT升高45.3%；用4G10（泛磷酸酪氨酸抗体）免疫沉淀后检测mGluR₅酪氨酸磷酸化水平，发现STEP KO中升高17.5%。这说明内源性STEP61在体内确实抑制mGluR₅表达并促进其酪氨酸去磷酸化。

（六）mGluR₅酪氨酸磷酸化缺失突变体表达降低

针对mGluR₅C末端四个酪氨酸（Y963、Y1060、Y1155、Y1163）及膜内Y821（阴性对照）构建单位点Y→A突变和四突变（4YAs）。在原代海马神经元中，Y821A表面表达与WT无差异，而Y963A、Y1060A、Y1155A、Y1163A分别将表面表达降至WT的70.9%、57.5%、48.7%和51.8%；4YAs表面表达降至54.4%。共表达Fyn不能恢复4YAs表面表达，共表达STEP61也不进一步降低其表达，表明这些酪氨酸残基的突变消除了STEP61和Fyn的调控作用。在HEK293T细胞中，4YAs总蛋白表达降至WT的26.9%，酪氨酸磷酸化水平降至56%。证实STEP61通过去磷酸化mGluR₅C末端酪氨酸来调节其表达。

五、讨论与结论

讨论部分指出，STEP61是一种脑特异性的跨膜酪氨酸磷酸酶，此前已知其调控NMDA和AMPA受体运输。本研究发现STEP61直接结合mGluR₅，并通过KIM/KIS结构域识别其C末端。STEP61和Fyn均可结合mGluR₅，分别介导去磷酸化与磷酸化，从而形成一种平衡机制。STEP61引起mGluR₅去磷酸化后，受体经内吞进入溶酶体降解，从而减少表面mGluR₅，可能削弱PLC/Ca²⁺下游信号。该调控独立于mGluR₅负向别构调节剂（NAMs），因为STEP61作用于C末端而非跨膜结构域。研究结论可翻译为：本文证实mGluR₅与STEP61之间存在直接相互作用，STEP61通过去磷酸化mGluR₅C末端酪氨酸残基，在原代培养神经元和体内负向调控mGluR₅的表达。这项研究揭示了酪氨酸去磷酸化在mGluR₅表面表达和蛋白稳定性调控中的关键作用，为mGluR₅相关神经精神疾病的机制研究和治疗策略提供了新线索。