《Food Science & Nutrition》：Panax notoginseng Saponins Accelerate Diabetic Wound Repair by Minimizing Mitochondrial Dysfunction and Inhibiting Pyroptosis of Macrophage via Regulating Ephx2/11,12-EET Axis
糖尿病创面（diabetic wound, DW）愈合障碍主要由过度炎症反应驱动，而三七总皂苷（Panax notoginseng saponins, PNS）作为三七的核心活性成分，在糖尿病溃疡中显示出促愈潜力但其机制尚不明确。本研究建立了链脲佐菌素诱导的糖尿病创面小鼠模型，结合非靶向代谢组学与体内外验证实验，阐明PNS的治疗机制及活性成分。在体内实验中，PNS剂量依赖性地加速创面闭合、增强胶原沉积，并改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，且不影响体重或随机血糖。机制上，PNS抑制巨噬细胞中Ephx2的表达（在mRNA和蛋白水平），从而上调11,12-EET，进而减轻创面炎症、NLRP3炎症小体介导的焦亡及线粒体功能障碍。在体外实验中，PNS对巨噬细胞线粒体功能和焦亡的保护作用不能被Ephx2抑制剂TPPU增强，但被11,12-EET拮抗剂14,15-EEZE完全消除。此外，从PNS中鉴定出五种主要皂苷（R1、Rg1、Re、Rb1、Rd）为其活性成分，均能在糖尿病创面小鼠中发挥促愈作用。综上所述，PNS通过调控巨噬细胞Ephx2/11,12-EET轴维持线粒体稳态并抑制焦亡，从而加速糖尿病创面愈合，为其治疗糖尿病足溃疡提供了理论依据。
研究背景与科学问题
糖尿病是一种以持续高血糖为主要特征的代谢性疾病，全球约有8.28亿成年人受其影响。长期高血糖常导致创面愈合机制受损，引发糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer, DFU），每20秒就有一例因DFU导致的截肢，五年死亡率接近30%。目前的DFU治疗策略主要集中在血糖控制和创面愈合上，但往往难以满足临床需求。因此，开发更有效、更具靶向性的药物干预措施以加速糖尿病创面愈合成为首要目标。
巨噬细胞是炎症和组织修复的核心调节者，其极化为促炎性M1型或促修复性M2型会改变创面微环境，这是难愈性DFU的关键病理特征。细胞焦亡（pyroptosis）因其特征性的过度炎症信号阻碍糖尿病创面愈合，这一现象在M1型巨噬细胞中尤为显著。近期研究表明，焦亡的发生归因于线粒体稳态失衡，特别是线粒体分裂（由动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1, Drp1）介导）和融合（由线粒体融合蛋白1/2（mitofusins 1/2, Mfn1/2）和视神经萎缩蛋白1（optic atrophy 1, OPA1）介导）异常。线粒体动力学紊乱会导致膜电位崩溃、线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species, mtROS）过量产生和泄漏，进而激活NLRP3炎症小体，触发gasdermin D（GSDMD）的蛋白水解活化，诱导焦亡并分泌促炎细胞因子，包括白细胞介素-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、IL-6和IL-18。
环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids, EETs），包括11,12-EET，是由花生四烯酸经细胞色素P450（cytochrome P450, CYP）环氧化酶产生的生物活性脂质介质，具有强效的抗炎和组织修复作用。然而，EETs的生物半衰期受到可溶性环氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase, sEH，由Ephx2基因编码）的严格调控，该酶可将EETs快速水解为生物活性大幅降低的二羟基二十碳三烯酸（dihydroxyeicosatrienoic acids, DHETs）。已有证据表明，sEH在糖尿病组织中的表达和活性升高，导致EETs加速降解，造成这些保护性介质缺乏，这与糖尿病血管并发症、创面愈合受损和慢性炎症的发病机制有关。基于此，研究人员采用非靶向代谢组学筛选PNS治疗前后糖尿病创面组织中的差异代谢物，从而将11,12-EET确定为PNS恢复的关键代谢物，促使研究人员将Ephx2/11,12-EET轴作为本研究的机制焦点。
三七（Panax notoginseng）是一种药食同源的中草药，用于活血消肿已有400多年历史。其主要生物活性成分为三七总皂苷（Panax notoginseng saponins, PNS），具有抗炎、抗氧化、免疫调节和线粒体保护特性。以PNS为主要成分的血栓通注射液在中国临床上广泛用于治疗高血糖引起的血管阻塞，并已应用于DFU的治疗。然而，PNS如何通过改善糖尿病创面代谢物来减少创面焦亡的机制尚不清楚。
研究方法概述
研究人员首先建立链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的糖尿病创面（diabetic wound, DW）小鼠模型，并设置不同剂量PNS口服给药组进行体内药效评估；随后运用非靶向代谢组学技术筛选差异代谢物；在体外实验中，采用高糖（high glucose, HG）联合脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）（简称HL）刺激RAW 264.7小鼠巨噬细胞系模拟糖尿病创面慢性炎症微环境；通过流式细胞术检测mtROS和线粒体膜电位；利用透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）观察线粒体超微结构；采用分子对接预测活性成分与靶蛋白的结合能力；并使用公共单细胞转录组数据集（GSE165816）分析人足部皮肤组织中相关基因的表达变化。
研究结果
3.1 PNS促进糖尿病小鼠创面愈合
在DW小鼠中，PNS治疗对体重或随机血糖无显著影响，但显著改善了葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。与正常创面（non-diabetic wound, NW）对照组相比，DW组创面愈合明显受损，而PNS治疗以剂量依赖性方式显著加速创面闭合。组织学检查显示，PNS治疗有效逆转了DW小鼠较大的上皮间隙、较高的炎症细胞浸润和较少的胶原沉积等病理变化。
3.2 PNS减轻糖尿病创面线粒体功能障碍并抑制焦亡
与NW小鼠相比，DW小鼠创面组织中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-18水平显著升高，而IL-10水平降低，PNS治疗则显著逆转了这些变化。免疫荧光染色显示，PNS治疗显著减少了M1型巨噬细胞浸润并增加了M2型巨噬细胞数量。蛋白质印迹分析证实PNS下调了iNOS、上调了Arg1表达。在焦亡相关标志物方面，PNS处理显著降低了NLRP3、pro-Caspase-1、活性Caspase-1 p20片段、全长GSDMD（FL-GSDMD）和N端GSDMD（N-GSDMD）的蛋白水平。透射电镜观察发现DW组创面组织存在严重的超微结构损伤，表现为核膜碎裂、电子致密体和线粒体肿胀，PNS治疗后得到显著改善。在线粒体动力学层面，PNS治疗有效恢复了平衡状态，即降低了Drp1活化（p-Drp1 Ser616/总Drp1比值下降）并促进了线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1的表达。
3.3 PNS通过抑制Ephx2提高11,12-EET水平
非靶向代谢组学分析鉴定出67种DW与NW之间的差异代谢物，其中17种经PNS处理后恢复正常水平。韦恩图分析确定了四个关键代谢节点，其中11,12-EET尤为重要。公共单细胞数据集（GSE165816）分析显示，与非糖尿病足溃疡（NDFU）患者相比，DFU患者巨噬细胞中Ephx2表达显著升高。体外实验证实，PNS选择性抑制RAW 264.7细胞中Ephx2的mRNA和蛋白表达，而非Ephx1或Cyp2J家族成员。此外，PNS增强了Ephx2蛋白的热稳定性，并以浓度依赖性方式逆转了HL刺激导致的11,12-EET水平降低。
3.4 PNS通过调控Ephx2/11,12-EET轴抑制巨噬细胞焦亡并减轻线粒体功能障碍
使用Ephx2抑制剂TPPU的实验结果显示，PNS和TPPU均能显著增加11,12-EET水平，但两者联用并未产生显著的协同增效作用。PNS和TPPU均能逆转HL诱导的巨噬细胞M1型极化（CD86表达升高）、减少促炎细胞因子分泌、降低焦亡细胞比例，并抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路蛋白表达。在线粒体动力学方面，PNS恢复线粒体融合/分裂平衡的作用同样未被TPPU进一步增强，表明Ephx2是PNS发挥药理效应的共同靶点。
3.5 11,12-EET功能丧失阻断PNS对线粒体的保护作用
采用11,12-EET拮抗剂14,15-EEZE的实验结果表明，14,15-EEZE完全逆转了PNS介导的mtROS抑制、线粒体形态保护、线粒体融合基因（Mfn1, Mfn2, OPA1）上调及分裂基因Drp1下调。此外，14,15-EEZE阻断了PNS对线粒体耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）的改善作用，以及对线粒体膜电位的调节作用，进一步证实Ephx2/11,12-EET轴是PNS发挥线粒体保护功能的关键通路。
3.6 11,12-EET在体内实验中作为PNS疗效的关键介质
在DW小鼠模型中，TPPU与PNS联用未显著增强创面闭合效果，而14,15-EEZE则完全消除了PNS的促愈作用。PNS对创面组织中Ephx2 mRNA的抑制和11,12-EET水平的提升作用被14,15-EEZE取消，但未被TPPU进一步增强。Masson染色显示PNS改善的胶原组织和密度被14,15-EEZE破坏，而GSDMD表达的抑制作用也被14,15-EEZE逆转。这些体内功能获得和缺失实验证明11,12-EET在PNS治疗糖尿病创面愈合中发挥着至关重要的作用。
3.7 鉴定PNS中靶向Ephx2/11,12-EET轴的活性皂苷成分
超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UPLC-QE-Orbitrap-MS）分析鉴定出PNS提取物中五种相对含量丰富的皂苷：三七皂苷R1（notoginsenoside R1, R1，15.90%）、人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1, Rg1，3.80%）、Re（3.85%）、Rb1（4.07%）和Rd（2.55%）。分子对接预测所有五种皂苷均能与Ephx2强烈结合。在DW小鼠模型中，各单体皂苷（10 mg/kg）均能显著加速创面闭合、促进胶原沉积、抑制Ephx2 mRNA表达、提升11,12-EET水平、降低促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18）水平并抑制GSDMD阳性表达，表明这五种皂苷构成了PNS治疗效果的重要物质基础。
讨论与结论
研究人员在讨论中指出，糖尿病创面愈合障碍涉及慢性炎症、代谢紊乱和细胞功能障碍等多因素机制。PNS在不显著降低随机血糖的情况下改善胰岛素敏感性，这对减少糖尿病并发症至关重要。本研究的创新之处在于聚焦于巨噬细胞活性而非传统的血管生成和细胞外基质重塑角度。PNS通过恢复线粒体动力学平衡、减少mtROS产生、抑制NLRP3炎症小体活化和GSDMD介导的焦亡，打破了创面微环境中持续的炎症恶性循环，使成纤维细胞恢复增殖和胶原合成能力，并为内皮细胞介导的血管生成创造了有利环境。
关于Ephx2/11,12-EET轴，研究人员确认PNS主要通过抑制Ephx2转录和翻译而非影响Cyp2J家族或Ephx1来调控11,12-EET水平。TPPU未能增强PNS效应提示二者可能共享相同靶点，而14,15-EEZE完全阻断PNS的线粒体保护和抗焦亡作用则确立了该轴的核心地位。五种活性皂苷通过共同的分子靶点发挥类似PNS的药理作用。
研究结论部分翻译如下：本研究揭示了三七总皂苷作为天然调节剂，通过靶向Ephx2/11,12-EET通路稳定巨噬细胞线粒体稳态、减少焦亡，从而促进糖尿病创面愈合。这些发现凸显了PNS作为糖尿病创面候选治疗药物的药理学潜力，并为糖尿病足溃疡治疗策略的进一步临床探索奠定了基础。
