《Molecular and Cellular Probes》：Serum extracellular vesicle-associated SNORD54 adds diagnostic information to CEA and CYFRA21-1 in non-small cell lung cancer: a case-control development study
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通过数据库和配对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）证据，SNORD54/41在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中过表达。与对照组相比，NSCLC患者（包括早期阶段）血清细胞外囊泡（EV）相关SNORD54/41水平升高。血清EV相关SNORD54将NSCLC诊断的
通过数据库和配对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）证据，SNORD54/41在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中过表达。与对照组相比，NSCLC患者（包括早期阶段）血清细胞外囊泡（EV）相关SNORD54/41水平升高。血清EV相关SNORD54将NSCLC诊断的癌胚抗原（CEA）和细胞角蛋白19片段21-1（CYFRA21-1）联合模型的曲线下面积（AUC）从0.851提升至0.951。SNORD54+CEA+CYFRA21-1组合在I-II期和I期NSCLC中保持高诊断效能。探索性实验显示，SNORD41促进NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭。
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的大多数，预后与确诊时的分期密切相关。低剂量计算机断层扫描（LDCT）可降低高危人群的肺癌死亡率，是循证筛查的主要手段，但LDCT也会检出大量性质不确定的肺结节，常需连续影像随访甚至侵入性诊断。基于血液的生物标志物若能以分子信息补充影像评估，将有助于肺结节的诊断分层和个体化决策。癌胚抗原（CEA）和细胞角蛋白19片段21-1（CYFRA21-1）是临床常用的血清标志物，但在早期肺癌中的独立诊断性能有限。细胞外囊泡（EV）是由脂质双层包被并携带蛋白质、脂质、DNA和多种RNA的细胞外颗粒，其膜结构能增强内容核酸在体液中的稳定性，其分子组成在一定程度上反映来源细胞的病理状态，因而EV富集样本成为液体活检标志物发现的重要资源。小核仁RNA（snoRNA）是细胞外RNA的组成部分，除经典的核糖体RNA加工功能外，还参与转录调控、应激反应及癌症相关信号通路。已有研究报告了多种癌症中snoRNA丰度异常，包括肺癌组织和循环样本。因此，评估特定的EV相关snoRNA能否为CEA和CYFRA21-1提供增量诊断信息，是符合临床转化方向的生物标志物开发问题。
研究人员开展了一项单中心病例对照生物标志物开发研究，系统评估血清EV相关SNORD54和SNORD41作为NSCLC诊断标志物的价值，并采用数据库分析、配对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织、配对血清EV检测等证据链，通过多变量建模考察其在常规血清标志物基础上的增量贡献。主要发现是，将SNORD54加入CEA和CYFRA21-1后，诊断模型的曲线下面积（AUC）从0.851提高到0.951，并且在I-II期和I期亚组中仍保持较高判别力；SNORD41与SNORD54高度相关，未提供独立增量信息，因此选择SNORD54+CEA+CYFRA21-1作为最简约的模型。该结果支持SNORD54作为液体活检多标志物策略的候选组分，其意义在于为肺结节等临床场景的分子风险评估提供了可继续开发的血液标志物。
在技术方法方面，研究人员采用数据库分析（基于SNORic的肺腺癌和肺鳞癌数据集及TCGA衍生数据）和配对FFPE组织qRT-PCR获取组织水平证据；通过差异超速离心从血清中富集EV，并采用透射电子显微镜（TEM）、可调谐电阻脉冲传感（TRPS）和免疫印迹（CD63、CD81、TSG101）进行表征；使用qRT-PCR（U6为参考，ΔCt值表示相对丰度）检测EV相关SNORD54/41，以电化学发光免疫分析测定CEA和CYFRA21-1。统计方法包括多变量逻辑回归、ROC曲线与DeLong检验、AIC/BIC、Brier分数、Bootstrap内验证等。样本来源为青岛大学附属泰安市中心医院2023年5月至9月采集的血清，完整病例队列含98例NSCLC和79例健康对照。此外，研究人员在A549和H1299细胞中对SNORD41进行了过表达/敲低的探索性功能实验。
结果部分分述如下：
研究人群：完整病例队列含98例NSCLC和79例健康对照。与对照组相比，NSCLC患者年龄更大（61.8±10.3对45.0±15.8岁；SMD=1.293）且吸烟比例更高（49.0%对29.1%；SMD=0.416），提示需进行人口学调整。
数据库和配对组织证据：在SNORic数据库的LUAD（940条记录）和LUSC（963条记录）及配对表达矩阵中，SNORD54和SNORD41均显示支持性的差异表达模式。TCGA衍生数据中，两者区分肿瘤与正常组织的AUC分别为0.841和0.898；在48对配对FFPE组织中，两者的ΔCt值在肿瘤组织显著低于配对邻近组织（Wilcoxon检验P<0.001），提示肿瘤组织中相对丰度更高。
EV富集组分表征：TEM观察到球形囊泡结构，TRPS显示颗粒粒径集中于小粒径范围，免疫印迹可检测到CD63、CD81和TSG101，证实EV富集成功。
血清EV相关SNORD54和SNORD41：在各自基因特异性血清队列中，NSCLC患者（包括早期和晚期）的U6归一化SNORD54和SNORD41 ΔCt均低于健康对照，即相对U6丰度升高。
诊断性能与模型选择：完整病例队列中，SNORD54、SNORD41、双RNA模型和CEA+CYFRA21-1模型的AUC分别为0.866、0.863、0.869和0.851。将SNORD54加入临床模型后，AUC升至0.951（ΔAUC=0.100，95%CI 0.050-0.150；DeLong检验P<0.001），在Youden指数确定的截止值0.562下，敏感性85.7%（95%CI 77.2%-92.0%），特异性94.9%（95%CI 87.5%-98.6%）。SNORD54和SNORD41强相关（Pearson r=0.924），在SNORD54存在时加入SNORD41的ΔAUC仅为0.0003（DeLong P=0.480），且似然比检验P=0.953，AIC和BIC增大，故选择SNORD54+CEA+CYFRA21-1作为简约模型。
早期亚组分析：将总体模型系数和截止值不加修改地应用于I-II期（44例）和I期（32例）亚组，SNORD54+临床模型的AUC分别为0.904（95%CI 0.843-0.964）和0.882（95%CI 0.804-0.960），敏感性分别为70.5%和68.8%，特异性均为94.9%；与临床模型相比，ΔAUC分别为0.224和0.250（均P<0.001）。表明模型在早期NSCLC中仍保持判别效能。
人口学敏感性分析：在年龄、性别、CEA和CYFRA21-1基础上加入SNORD54，AUC从0.907升至0.961（ΔAUC=0.054，95%CI 0.019-0.088；P=0.002），Brier分数从0.123降至0.075；进一步调整吸烟后，AUC从0.910升至0.962（ΔAUC=0.052，P=0.004）。说明SNORD54的增量信息不受人口学因素干扰。
Bootstrap内部验证：2000个分层重采样均有效，所择模型的平均乐观度为0.003，乐观校正AUC为0.948，乐观校正Brier分数为0.087，校准截距0.015，校准斜率0.948，支持模型内部稳定性。
U6归一化敏感性分析：病例组与对照组间U6 Ct存在差异（Cohen's d分别为0.805和0.769），但在重建目标Ct并调整U6后，SNORD54和SNORD41仍与NSCLC病例状态显著相关（系数分别为-1.674和-1.595，P<0.001），表明目标RNA信号并非U6差异造成的假象。
SNORD41的探索性功能实验：在A549和H1299细胞中，SNORD41过表达伴随增殖、集落形成、迁移和侵袭指标升高，敲低则呈相反方向。由于缺乏独立生物学重复，仅作描述性解释，不作为确证性结论。
讨论部分，研究人员总结了SNORD54作为EV相关标志物的增量价值，强调其与SNORD41的相关性以及对简约模型的选择意义。组织水平证据提供了生物学一致性，血清多变量分析则确定了SNORD54的独立贡献。早期亚组和人口学调整分析支持模型的稳健性，Bootstrap内验证显示乐观度低。局限性方面，单中心病例对照设计、健康对照组不能完全模拟真实诊断人群（如良性肺结节、炎症性肺病等）、样本量有限、EV富集法不能完全排除非囊泡组分、FFPE保存信息缺失、SNORD41功能实验为探索性等，均需后续完善。未来主要方向是在包含良性肺结节等代表性诊断人群中开展多中心验证，并推动EV富集和RNA归一化的分析标准化。
结论：在单中心NSCLC病例对照队列中，血清EV富集组分中测得的SNORD54在CEA和CYFRA21-1基础上提供了增量判别力。三标志物模型将AUC从0.851提升至0.951，并在I-II期和I期NSCLC中分别保持0.904和0.882的AUC。Bootstrap分析得到的乐观校正AUC为0.948，支持所择模型的内部稳定性。SNORD41在单变量分析中与NSCLC相关，但加入SNORD54后无实际增量信息，故支持采用更简约的SNORD54+CEA+CYFRA21-1组合。上述结果将SNORD54推向生物标志物开发的下一阶段，即EV富集和RNA归一化的分析标准化，以及在包含良性肺结节等临床相关疾病的队列中开展独立验证。
