核糖体相关伴侣蛋白DNAJC2通过调控翻译通量减轻共翻译质量控制负担

《Molecules and Cells》：Ribosome-associated chaperone DNAJC2 titrates translation flux to alleviate the burden of co-translational quality control

　　

异常翻译过程中发生的核糖体碰撞会激活核糖体相关质量控制（ribosome-associated quality control，RQC），以解决停滞的核糖体复合物并分拣不完整的新生链。这种共翻译监视如何与其他核糖体相关活性相协调仍不清楚。在此，研究人员鉴定出核糖体相关Hsp40伴侣蛋白DNAJC2，该蛋白在易发生碰撞的翻译过程中抑制翻译通量并限制RQC的参与。遗传上位性分析（genetic epistasis analysis）揭示，DNAJC2通过经典RQC通路（从碰撞感知因子ZNF598到下游NEMF-LTN1 E3连接酶复合物介导的蛋白酶体降解）滴定异常翻译中间体的通量。DNAJC2缺失进一步使细胞对碰撞诱导的核糖毒性应激反应（ribotoxic stress response，RSR）敏感化，表明细胞对全局翻译应激的易感性增加。机制上，DNAJC2缺失加速了翻译延伸，从而促进核糖体碰撞和ZNF598依赖的核糖体解体。相应地，使用翻译抑制剂高三尖杉酯碱（homoharringtonine）或亨廷顿上游开放阅读框（upstream ORF）降低翻译通量，可挽救DNAJC2缺失在RQC敏感的多聚腺苷酸（poly-A）介导的翻译停滞中的表型。综上所述，研究人员提出DNAJC2作为翻译变阻器（translational rheostat），缓冲核糖体碰撞、防止RQC过载，并设定RSR激活的阈值。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

蛋白质合成是基因表达的核心环节，其准确性直接关系到细胞稳态。在翻译过程中，核糖体沿mRNA行进时可能遭遇异常情况——例如mRNA模板异常（如编码多聚赖氨酸的poly-A序列）、异常翻译事件（如停滞诱导的新生多肽翻译、终止密码子通读）以及细胞应激（如氨基酸缺乏）——这些情况会导致核糖体停滞，进而引发相邻核糖体之间的碰撞。核糖体碰撞是核糖体相关质量控制（RQC）通路的关键触发信号。在RQC过程中，限速E3连接酶ZNF598识别碰撞的核糖体，对其40S亚基核糖体蛋白（如RPS10、RPS20）进行泛素化修饰，随后招募RQT复合物（ASCC2-ASCC3-TRIP4）解体停滞的80S核糖体，NEMF结合60S-新生链复合物并介导CAT尾巴添加，最终由LTN1 E3连接酶泛素化异常新生链并靶向蛋白酶体降解。

然而，RQC如何在正常翻译减速与病理性核糖体停滞之间做出选择性判断，始终是该领域的核心难题。过度激活RQC会错误处理正常翻译中间体，而激活不足则无法清除异常产物。因此，理解核糖体相关伴侣蛋白如何与RQC机制协调，对于阐明细胞如何在高效蛋白质合成与共翻译质量控制之间取得平衡至关重要。

核糖体相关伴侣蛋白是另一类共翻译调控因子，在翻译延伸期间于核糖体隧道出口协助新生链的正确折叠。真核生物中存在两类核糖体伴侣复合物：新生多肽相关复合物（NAC）和核糖体相关复合物（RAC）。其中RAC由DNAJC2/ZUO1/MPP11/ZRF1与HSPA14/HSP70L1两个异源二聚体组成。酵母研究已揭示RAC通过跨越40S和60S亚基的结构模式抑制核糖体易位，将翻译延伸与新生链共翻译折叠相耦合。然而，哺乳动物RAC的功能远不如酵母中清晰——酵母与哺乳动物的RAC同源物结构域结构存在显著差异，且酵母RAC与核糖体结合Hsp70 Ssb协同作用，因此哺乳动物RAC是否同样协调翻译延伸、新生链处理和共翻译监视等不同核糖体活性，尚不清楚。

二、研究目的

本研究旨在阐明哺乳动物RAC组分DNAJC2与RQC通路之间的功能联系，验证DNAJC2是否作为上游调控因子在易碰撞翻译过程中调节RQC的参与程度。

三、主要技术方法

研究人员以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞（ATCC, CRL-2266）为主要实验模型，综合运用了以下关键技术手段：双荧光翻译报告系统（GFP-P2A-K(AAA)_0/20-P2A-RFP）结合流式细胞术定量检测翻译停滞与RQC活性；免疫印迹分析翻译报告产物（区分全长FLAG产物与翻译停滞产物AP）；蔗糖密度梯度多聚体分析（polysome profiling）评估核糖体分布与翻译状态；siRNA筛选及CRISPR-Cas9基因敲除（ZNF598、NEMF、LTN1、ZAK）进行遗传上位性分析；嘌呤霉素标记结合harringtonine run-off实验测定翻译延伸速率；叠氮高丙氨酸（AHA）点击化学标记结合共聚焦显微镜定量新生多肽合成；JNK-KTR荧光激酶转位报告系统结合活细胞成像监测JNK激活动力学；Phos-tag凝胶电泳和磷酸化特异性抗体检测RSR相关激酶磷酸化；实时定量PCR检测RSR靶基因转录。

四、研究结果

（一）核糖体伴侣蛋白DNAJC2促进RQC敏感的多聚腺苷酸翻译

通过靶向多核苷酸结合蛋白和翻译偶联质量控制因子的RNAi筛选，研究人员发现DNAJC2缺失最显著地加剧了K(AAA)₂₀报告基因上的翻译停滞，而对K(AAA)₀和K(AAA)₅对照报告基因影响甚微。ZNF598基因敲除可消除DNAJC2缺失的表型，表明DNAJC2功能与ZNF598敏感的翻译停滞存在功能联系。免疫印迹分析证实DNAJC2缺失抑制poly-A通读并增加翻译停滞产物（AP）积累。RAC另一组分HSPA14的敲低可表型复制DNAJC2效应，而NAC组分（NACA、BTF3）敲低无此效应。蛋白酶体抑制剂MG-132处理可掩盖DNAJC2对停滞产物水平的影响但不影响翻译停滞本身，提示蛋白酶体依赖性周转参与停滞产物的稳态调控。

（二）DNAJC2缺失增强内源XBP1u停滞序列翻译停滞产物的积累

将人未剪接XBP1（XBP1u）C端序列（残基226–261）插入双荧光报告系统后，DNAJC2缺失增加了野生型XBP1u报告基因的停滞产物水平。进一步使用野生型、强停滞S255A和弱停滞W256A突变体报告基因，发现DNAJC2缺失在野生型和S255A报告基因中一致增加停滞产物积累，而W256A报告基因无显著变化，表明DNAJC2效应依赖于报告序列的停滞特性。

（三）DNAJC2限制碰撞倾向翻译负荷作用于经典RQC通路

遗传上位性分析显示，ZNF598缺失抑制K(AAA)₂₀报告基因的停滞产物生成并消除DNAJC2效应；LTN1缺失与DNAJC2敲低在停滞产物积累上呈现协同效应；NEMF缺失导致较小的停滞产物种类并削弱DNAJC2效应，但不影响DNAJC2敏感的poly-A翻译停滞。ASCC3（RQT复合物RNA解旋酶）敲低本身缓解K(AAA)₂₀翻译停滞并抑制停滞产物生成，同时强力抑制DNAJC2缺失细胞中的停滞产物积累；而HBS1L（no-go decay核糖体救援因子）敲低无此效应。这些结果表明DNAJC2作用于经典RQC通路的上游，通过滴定ZNF598引发的核糖体和RQT介导的解体过程，减少随后由NEMF处理并经LTN1依赖蛋白酶体清除的停滞新生链底物的产生。

（四）DNAJC2滴定核糖体碰撞诱导的RSR激活

DNAJC2缺失将anisomycin诱导RSR的有效浓度窗口向低浓度方向移动，促进anisomycin诱导的ZAKα磷酸化及下游JNK和p38磷酸化。JNK-KTR活细胞成像证实DNAJC2缺失加速JNK激活，而ZNF598缺失显著削弱此表型。ZAK抑制剂（sorafenib、nilotinib）或ZAK敲低可完全抑制JNK-KTR激活。定量PCR分析表明DNAJC2缺失增强anisomycin诱导的RSR靶基因（JUN、ATF3）转录，而ZNF598或ZAK基因敲除可抑制此效应。

（五）DNAJC2抑制全局翻译通量以减轻碰撞倾向翻译中的RQC负担

AHA标记实验显示DNAJC2缺失细胞的新生多肽合成更为旺盛。蔗糖密度梯度分析表明DNAJC2缺失细胞基线多聚体/单核糖体比值更高，harringtonine run-off实验证实这些多聚体处于活跃翻译状态。嘌呤霉素标记结合harringtonine处理显示DNAJC2缺失细胞翻译延伸速率更快。在anisomycin诱导碰撞条件下，DNAJC2缺失细胞表现出更大的多聚体丢失、60S亚基和halfmer积累，且这些效应在ZNF598缺失细胞中完全消失，表明升高的多聚体含量增加了核糖体碰撞可能性并促进ZNF598依赖的RQC。

（六）降低翻译通量挽救DNAJC2在多聚腺苷酸翻译中的表型

低剂量homoharringtonine处理（可逆性翻译起始抑制剂）剂量依赖性地降低K(AAA)₀报告基因整体表达但不影响mCherry/GFP比值，而特异性缓解K(AAA)₂₀报告基因的翻译停滞并降低停滞产物水平，且在DNAJC2缺失细胞中抑制效果更为显著。将亨廷顿uORF插入报告基因5'UTR可抑制下游编码序列的翻译起始，同样特异性缓解K(AAA)₂₀翻译停滞并大幅挽救DNAJC2缺失表型。

五、总结与讨论

本研究鉴定出核糖体相关Hsp40伴侣蛋白DNAJC2作为翻译通量的变阻器，通过限制翻译延伸速率来缓冲核糖体碰撞、防止RQC过载并设定RSR激活阈值。DNAJC2缺失加速翻译延伸，增加多聚体加载和核糖体碰撞概率，从而将更多异常翻译中间体导入ZNF598依赖的经典RQC通路，同时降低细胞对全局翻译应激的耐受性。降低翻译通量（药理学或遗传学手段）可有效挽救DNAJC2缺失表型，进一步验证了这一模型。该研究首次在哺乳动物系统中建立了RAC与RQC通路之间的功能串话，揭示了核糖体相关伴侣蛋白在协调高效蛋白质合成与共翻译质量控制中的关键作用，为理解核糖体碰撞相关疾病（如神经退行性疾病、发育异常和衰老）的分子机制提供了新视角。