《Materials Today Communications》：Bitter Gourd Flower Extract-Capped Hydroxyapatite Nanocomposite: A Dual-Function Biomaterial for Enhanced Bone Regeneration in Diabetic Conditions
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在糖尿病等挑战性生理条件下，开发能够促进骨再生的特异性生物材料至关重要。本研究详述了一种新型羟基磷灰石（HAP）与苦瓜花提取物（BFE）纳米颗粒（BFE-HAP）的无毒合成及全面表征，并评估其在高血糖条件下用于骨组织工程的疗效。傅里叶变换红外光谱（FTIR）、
在糖尿病等挑战性生理条件下，开发能够促进骨再生的特异性生物材料至关重要。本研究详述了一种新型羟基磷灰石（HAP）与苦瓜花提取物（BFE）纳米颗粒（BFE-HAP）的无毒合成及全面表征，并评估其在高血糖条件下用于骨组织工程的疗效。傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和透射电子显微镜（TEM）分析验证了纳米颗粒的有效合成与修饰。这些分析表明，BFE中的天然化合物有效封端并稳定了材料，形成了具有均匀球形纳米颗粒的纯相复合材料。使用人骨肉瘤MG-63细胞的体外生物学实验展示了BFE-HAP优异的细胞相容性和多样的治疗效果。在高糖条件下，纳米颗粒不仅保持了细胞活力（MTT、AO/PI），还通过维持核完整性（DAPI）、保持线粒体完整性（MMP）和减少氧化应激（ROS）表现出显著的细胞保护作用。此外，BFE-HAP显著增强了关键愈合过程，包括细胞迁移（通过伤口愈合方法测试）、早期成骨细胞分化（ALP活性）和后期矿物质沉积（ARS染色），减轻了高血糖的有害影响。研究结果强调，BFE-HAP纳米颗粒作为一种具有双重作用的潜在生物材料：既作为骨生长的支架，又提供愈合效果，使其适用于糖尿病患者的骨修复。最后，强调了基于HAP材料的关键挑战和未来前景。基于HAP的纳米复合材料在生物医学应用中显示出前景，包括再生医学和伤口管理，值得进一步研究以验证其治疗潜力和临床适用性。
一、研究背景与意义
糖尿病（DM）是全球范围内导致过早死亡、发病率和医疗费用增加的重要原因。据世界卫生组织（WHO）和全球健康评估数据显示，糖尿病相关死亡率从2019年的160万上升至2021年的超过200万。糖尿病相关的骨愈合机制受损是临床面临的重大挑战。慢性高血糖会降低胶原交联、骨柔韧性和机械强度，通过增加骨基质中的晚期糖基化终末产物（AGEs）损害骨质量；胰岛素抵抗和不足会阻碍成骨细胞发育和骨形成；低度炎症和氧化应激也会对骨骼造成损伤。此外，糖尿病神经病变、血管病变和伤口愈合延迟可导致糖尿病足溃疡（DFUs），严重时甚至需要截肢。
羟基磷灰石（HAP；Ca??(PO?)?(OH)?）作为一种磷酸钙陶瓷，其成分与人骨矿物质组成高度相似，具有优异的生物相容性、骨传导性、骨诱导性和生物活性，被认为是骨组织工程和再生的理想材料。然而，在糖尿病条件下，单纯依靠HAP的骨传导性不足以克服高血糖环境对骨代谢的抑制作用。黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化和促成骨特性，但植物提取物中的多酚和三萜类化合物存在吸收差、水溶性低、首过代谢快等限制，难以在靶部位达到有效浓度。
为解决上述问题，研究人员利用纳米技术构建了苦瓜花提取物（BFE）封端羟基磷灰石纳米复合材料（BFE-HAP），旨在通过双重作用机制——HAP提供骨传导支架，BFE中的生物活性成分（如苦瓜苷、黄酮类、多酚类）提供抗氧化、抗炎和抗糖尿病活性——来促进糖尿病条件下的骨再生。
二、研究内容与结论
研究人员采用湿化学沉淀法合成了纯HAP和不同浓度BFE掺杂的HAP纳米复合材料（BFE-HA-1至BFE-HA-4，分别对应0.2%、0.4%、0.6%和0.8% w/v的BFE浓度），并对其进行了系统表征和体外生物学评价。研究结果表明，BFE-HAP-2（0.4% BFE）复合材料在保持相纯度的同时降低了结晶度，被选为后续所有生物学研究的最佳配方。
体外实验采用人骨肉瘤MG-63细胞系（来源于印度浦那国家细胞科学中心NCCS），在模拟糖尿病（高糖）条件下评估了BFE-HAP-2纳米颗粒的治疗效果。研究证实，BFE-HAP-2纳米颗粒不仅具有良好的细胞相容性，还能有效保护细胞免受高糖诱导的损伤，促进成骨分化和基质矿化，具有作为糖尿病骨再生双功能生物材料的巨大潜力。
三、主要关键技术方法
本研究采用湿化学沉淀法合成纯HAP和BFE掺杂的HAP纳米复合材料，通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和高分辨透射电子显微镜（HR-TEM）结合选区电子衍射（SAED）对材料进行表征。生物学评价方面，使用MG-63人骨肉瘤细胞系（来源于印度浦那NCCS），开展了MTT细胞活力检测、伤口愈合细胞迁移实验、AO/PI双染活力检测、DAPI核染色、罗丹明123（Rh123）线粒体膜电位（MMP）检测、DCFH-DA活性氧（ROS）检测、碱性磷酸酶（ALP）活性测定和茜素红S（ARS）矿化染色等系列实验。
四、研究结果
4.1 FTIR分析
FTIR光谱证实了BFE对HAP表面的成功功能化修饰。纯HAP显示出典型的磷酸根（PO?3?）不对称伸缩振动峰（1087和1026 cm?1）、对称伸缩振动峰（962 cm?1）和弯曲振动峰（603和564 cm?1），以及晶格羟基（OH?）的伸缩振动峰（3572 cm?1）和平动模式峰（631 cm?1）。BFE-HAP复合物光谱中，3572 cm?1处晶格OH?峰强度显著降低，表明BFE中的植物化学物质（尤其是含羧基-COOH和羟基-OH的官能团）与HAP表面的Ca2?离子发生了螯合作用，形成了稳定的有机-无机纳米复合物。
4.2 XRD分析
XRD图谱显示纯HAP具有高结晶度的六方晶相结构，特征反射峰位于25.9°、31.8°、32.2°和32.9°，分别对应（002）、（211）、（112）和（300）晶面，与羟基磷灰石标准卡片（JCPDS Card No. 09-0432）一致。所有BFE-HAP复合物均保持六方HAP相，无杂相出现。但随着BFE浓度增加（0.4%及以上），衍射峰明显宽化和强度降低，表明晶粒尺寸和结晶度显著减小，这归因于BFE中的生物活性植物化学物质对晶核形成和生长的封端与稳定作用。
4.3 TEM分析
TEM观察显示，纯HAP呈不规则球形，粒径分布不均且易团聚。而BFE-HAP复合物呈现清晰、离散、规则且单分散性更好的球形纳米颗粒。这种形貌转变归因于BFE中的多酚和黄酮类化合物作为有效的螯合和封端剂，通过螯合Ca2?离子并吸附在HAP核上，调控成核和生长动力学，防止团聚。SAED图谱进一步证实，低浓度BFE掺杂（0.2%和0.4%）时HAP保持完整晶体结构，而高浓度（0.6%和0.8%）时出现结晶缺陷或弥散环，表明结晶度受损，与XRD结果一致。
4.4 细胞相容性实验
MTT实验表明，在正常条件下，BFE-HAP-2纳米颗粒在12.5至100 μg/ml全浓度范围内均表现出优异的细胞相容性，24小时孵育后细胞活力均超过85%，符合ISO 10993-5标准对生物材料的活性要求。在模拟糖尿病（高糖）条件下，BFE-HAP-2处理组相比对照组表现出明显的促增殖效应，细胞活力在所有剂量下均保持在85%以上。明场显微镜观察显示处理组细胞形态健康、呈纺锤形，融合度高。
4.5 伤口愈合实验
在高糖条件下，未处理的对照组细胞向划痕区域的迁移缓慢且24小时后仍未完全闭合。而经100 μg/ml BFE-HAP-2纳米颗粒处理的细胞在12小时和24小时表现出加速和广泛的细胞迁移，24小时时伤口几乎完全闭合，表明BFE-HAP-2能有效促进高糖条件下骨细胞的迁移和增殖能力。
4.6 AO/PI双染实验
AO/PI双染结果显示，高糖条件下未处理对照组随时间推移出现红色荧光（死细胞）增加。而BFE-HAP-2处理组在6、12和24小时均表现出强烈的绿色荧光和极少的红色染色，表明纳米颗粒处理有效维持了细胞活力，减轻了高糖诱导的细胞损伤，具有显著的细胞保护作用。
4.7 DAPI核染色实验
DAPI染色显示，BFE-HAP-2处理组在各时间点均表现出更高密度的蓝色荧光核，表明细胞数量更多、核完整性更好，进一步证实了纳米颗粒在高糖条件下对细胞活力的保护作用。
4.8 线粒体膜电位（MMP）检测
Rh123荧光染色显示，未处理对照组在高糖条件下绿色荧光显著降低，表明线粒体应激和潜在损伤。而BFE-HAP-2处理组在6、12和24小时均表现出增强且持续的绿色荧光，表明纳米颗粒有效维持了线粒体膜电位，保护了线粒体功能。
4.9 活性氧（ROS）检测
DCFH-DA荧光探针检测显示，未处理对照组的绿色荧光随时间呈进行性增加，表明高糖诱导的细胞内ROS水平升高和氧化应激。而BFE-HAP-2处理组在各时间点的荧光强度均显著降低，证实了纳米颗粒有效抑制ROS产生，具有抗氧化能力。
4.10 ALP活性测定
ALP作为成骨细胞早期分化的标志物，在未处理对照组中14天内活性持续降低，表明高糖环境抑制了成骨分化。而BFE-HAP-2处理组的ALP活性在1、7和14天均显著高于对照组，呈时间依赖性升高，表明纳米颗粒有效促进了高糖条件下的成骨分化。
4.11 ARS矿化染色
ARS染色用于评估晚期成骨分化和基质矿化。未处理对照组的钙沉积量极低，14天内仅有微小增加，表明高糖严重损害了细胞的成熟和矿化能力。而BFE-HAP-2处理组在各时间点均表现出显著增强的矿化结节形成，第14天差异最为显著，证实纳米颗粒促进了完整的骨形成过程。
五、讨论与结论
研究人员指出，高糖模型仅提供了糖尿病骨微环境的简化代表，实际糖尿病骨微环境还涉及AGEs积累、炎症和氧化应激等因素。未来研究应纳入AGEs和TNF-α等额外应激因素，并评估炎症、氧化应激和成骨标志物，以进一步验证该纳米复合物在糖尿病骨再生中的疗效。
研究结论确认了多功能BFE-HAP-2纳米颗粒在糖尿病骨再生中的显著治疗潜力。BFE中的生物活性植物化学物质作为优异的封端剂，制备出纯相、纳米晶、具有最佳均匀球形形态的纳米颗粒。体外研究显示，即使在严重高血糖条件下，BFE-HAP-2也表现出卓越的生物相容性和强生物功能特性。纳米颗粒在多项检测（MTT、AO/PI、DAPI）中证实无毒性，并通过维持MMP和清除ROS有效缓解细胞应激。BFE-HAP-2通过增强细胞增殖和迁移、促进成骨分化和基质矿化（表现为ALP活性和ARS染色的时间依赖性升高），显著改善了骨再生的关键过程。BFE-HAP-2纳米颗粒有望成为一种双功能生物材料，既作为治疗剂减轻高血糖的有害影响，又作为骨传导支架促进有效的骨再生和伤口愈合，适用于糖尿病患者的骨修复。
