Clitocine诱导LAMB3无义突变翻译通读并改善交界型大疱性表皮松解症角质形成细胞黏附与存活

《Matrix Biology》：Clitocine for Translational Readthrough in Junctional Epidermolysis Bullosa

　　

•Clitocine是导致JEB（junctional epidermolysis bullosa，交界型大疱性表皮松解症）的最常见且反复出现的LAMB3无义突变的强效翻译通读诱导剂，该突变将第635位精氨酸替换为提前终止密码子（PTC，premature termination codon）。
•Clitocine诱导JEB角质形成细胞中层粘连蛋白β₃链表达，即使蛋白量较低，也显著改善其存活和黏附。
•经Clitocine处理JEB角质形成细胞后，LAMB3上调伴随ECM（extracellular matrix，细胞外基质）蛋白基因网络的表达正常化。
•Clitocine对JEB角质形成细胞具有正向影响，而对正常人角质形成细胞具有明显毒性。

交界型大疱性表皮松解症（JEB，junctional epidermolysis bullosa）是一种罕见、遗传异质性机械性大疱性疾病，目前无治愈方法。其最常见病因为层粘连蛋白-332（LAM332，laminin-332）缺陷。LAM332将表皮角质形成细胞锚定于下方真皮，并维持皮肤和黏膜上皮结构完整性；除结构作用外，LAM332还参与表皮干细胞维持和组织稳态。LAMA3、LAMB3或LAMC2双等位基因致病变异分别编码层粘连蛋白α₃、β₃和γ₂链，导致不同严重程度的JEB-LAM332。中间型JEB-LAM332患者伤口愈合受损和过度炎症易发生上皮性皮肤癌。JEB-LAM332管理主要为对症治疗，聚焦伤口护理和支持措施，但许多治疗需求仍未满足。基因和干细胞治疗虽有效，但因复杂和昂贵尚未临床可用，其他纠正方法仍处于临床前研究。鉴于多数患者至少一个等位基因携带无义突变，翻译通读治疗具有前景。LAMB3（NM_000228.4）c.1903C>T，p.R635^*是JEB-LAM332患者最常见变异。无义突变在mRNA中产生提前终止密码子（PTC，premature termination codon），导致截短蛋白产生，并可能触发无义介导的mRNA降解（NMD，nonsense-mediated decay），阻止截短蛋白产生。翻译通读诱导药物（TRIDs，translation readthrough-inducing drugs）如庆大霉素（G，gentamicin）可绕过PTC，产生功能性全长蛋白。G在LAMB3无义变异所致JEB-LAM332中显示通读活性，并用于短期临床研究，但TRIDs临床应用受疗效和不良反应限制。氨基糖苷类长期治疗可致肾毒性和耳毒性，疗效也可能随致病变异而异。青蒿琥酯（ART，artesunate）在LAMB3缺陷HaCaT细胞中增强通读，并用于一例JEB。RiboScreen技术在幼稚酵母细胞中鉴定ART、阿扎那韦（ATZ，atazanavir）单用或联用以及红霉素（ERY，erythromycin）可增强全长LAMB3报告蛋白产生。Zandanell等回顾未发表数据，报告Clitocine在LAMB3 c.1903C>T（p.R635^*）变异专用报告实验诱导显著萤火虫荧光素酶活性。基于已发表通读活性报告，研究人员选择TRIDs G、ART、ATZ、ERY和Clitocine，评估携带LAMB3无义突变双等位c.1903C>T（p.R635^*）（JEB-R635^*）和c.124C>T；c.1903C>T（p.R42^*；p.R635^*）（JEB-R42^*R635^*）的患者来源永生化角质形成细胞。研究人员还评估TRID-C5，其组合G和巴龙霉素（P，paromomycin）与NMD抑制剂CC-90009和NMDI-14，以及抗氧化剂apocynin和melatonin，依据是NMD抑制增强通读、抗氧化剂预防氨基糖苷相关毒性。研究人员应用先前建立的筛选平台，结合药物处理、免疫印迹、细胞脱离实验、体外伤口愈合实验和转录组学。在所有测试药物中，Clitocine是唯一强效化合物，能促进翻译通读、恢复JEB-R635^*角质形成细胞中层粘连蛋白β₃链并改善黏附。这些结果提示Clitocine对JEB-LAM332具有纠正分子缺陷的潜力。

关键技术方法：研究人员使用来自健康供体和JEB患者的皮肤活检分离的原代角质形成细胞；患者1为LAMB3 c.1903C>T（p.Arg635Ter）p.R635^*纯合，患者2为c.1903C>T（p.R635^*）与c.124C>T（p.Arg42Ter）p.R42^*复合杂合；研究获弗赖堡大学伦理委员会批准（EK Freiburg 22-1208-S1）。细胞经E6E7基因永生化后在角质形成细胞生长培养基中培养。关键技术包括药物处理、免疫印迹、免疫荧光、基于胰酶的细胞脱离实验、MTT实验、体外伤口闭合实验以及转录组RNA测序与GO/Reactome/STRING分析。

研究结果如下。TRIDs在JEB-LAMB3中的筛选（Screening of TRIDs in JEB-LAMB3）：研究人员使用来自两例携带LAMB3无义突变患者和正常健康供体的永生化角质形成细胞，分别以ART 32 μM、ATZ 6.4 nM、Clitocine 1.35 μM、ERY 8 μM、G或TRID-C5处理一次，处理后两天收获细胞裂解物并进行免疫印迹。G 0.5 μg/μL在两种角质形成细胞中诱导低水平蛋白表达。TRID-C5含G 0.003 μg/μL，在JEB-R42^*R635^*中诱导更低水平层粘连蛋白β₃链，在p.R635^*中未检测到层粘连蛋白β₃蛋白。Clitocine处理在两种细胞系中导致最强LAMB3链表达。ART、ATZ和ERY未产生可检测LAMB3链表达。基于此，后续实验聚焦Clitocine通读效应。

Clitocine剂量与药物组合的优化（Optimization of Clitocine Dosage and Drug Combinations）：研究人员结合免疫印迹、细胞活力和细胞脱离实验测试Clitocine剂量。单次递增剂量Clitocine（0.337、0.675、1.35、2.7和5.4 μM）在JEB-R635^*中呈剂量依赖性恢复LAMB3链水平，5.4 μM较2.7 μM无额外增加。所有测试浓度0.675、1.35、2.7和5.4 μM均显著改善JEB-R635^*细胞形态和黏附。基于胰酶的细胞脱离实验显示，Clitocine显著减少JEB-R635^*细胞脱离，0.675 μM、1.35 μM和2.7 μM的P值均小于0.0001；2.7 μM使细胞黏附较载体处理增加约8.5倍，0.675和1.35 μM增加约6倍。因此选择2.7 μM进行后续实验。研究人员进一步测试Clitocine与含CC-90009 30 nM、apocynin 25 μM和melatonin 25 μM的C+ Cocktail组合。C+ Cocktail未较Clitocine单药进一步增加层粘连蛋白β₃链量；Clitocine未显著降低JEB-R635^*角质形成细胞活力，而与抗氧化剂组合使细胞活力下降40%（P<0.0001）。体外伤口闭合实验使用500 μm无细胞间隙，单次Clitocine处理后两天，JEB和正常角质形成细胞均闭合间隙；与载体处理相比，Clitocine处理JEB角质形成细胞迁移和增殖率相似，但形态和黏附改善。单次2.7 μM Clitocine处理后两天，JEB-R635^*中LAMB3链量约为正常人类角质形成细胞（NHKs，normal human keratinocytes）的10%，JEB-R42^*R635^*中约为29.2%。免疫荧光确认JEB-R635^*在2.7 μM Clitocine处理后合成LAMB3链；条件培养基中检测到新合成LAMB3链，且培养细胞将LAMB3和LAMA3链沉积到细胞外基质，表明恢复的蛋白不仅在细胞内表达，还被分泌并整合入细胞外基质。总体而言，单次2.7 μM Clitocine恢复LAMB3链，而与eRF3降解剂CC-90009和/或抗氧化剂组合既未改善蛋白产量，也未增强JEB-LAMB3角质形成细胞存活。

Clitocine在JEB-LAM332角质形成细胞中通读的给药方案（Dosage Regimen of Clitocine for Readthrough in JEB-LAM332 Keratinocytes）：由于LAM332是分泌并沉积的蛋白，研究人员测试其量是否随时间增加。JEB-R635^*接受单次2.7 μM Clitocine处理，并在两天、四天或六天后收集细胞裂解物，恢复的LAMB3链水平在该时间段保持稳定。Clitocine处理JEB-R635^*细胞和载体处理NHKs在第六天达到100%融合，而Clitocine处理NHKs和载体处理JEB-R635^*细胞逐渐死亡，变圆并从培养表面脱落。MTT实验结果支持这些观察。研究人员进一步研究重复Clitocine处理是否增加通读效应。JEB-R635^*每日接受2.7 μM Clitocine处理两天或四天，四天处理较两天方案使LAMB3链显著增加20%（P<0.05），且四天Clitocine处理不影响JEB-R635^*细胞形态。总体而言，JEB-R635^*在单次Clitocine处理后维持稳定的功能相关LAMB3链水平，重复处理使蛋白水平增加20%。Clitocine通过表达LAMB3链并改善黏附和存活对JEB-LAMB3细胞产生正向影响；相反，Clitocine对NHKs产生负面影响。

Clitocine对角质形成细胞的全局影响（Global Impact of Clitocine on Keratinocytes）：研究人员进行转录组分析，测定2.7 μM Clitocine对JEB-R635^*和NHKs的全局影响。总RNA提取自Clitocine或载体处理细胞，并通过bulk RNA测序分析。Clitocine处理导致JEB-R635^*中3,635个基因表达改变，其中2,099个上调、1,536个下调，log₂[fold-change] ≥ 1且校正P值（padj）≤ 0.05；NHKs中4,927个基因受影响，其中2,715个上调、2,212个下调，log₂[fold-change] ≥ 1且padj ≤ 0.05。值得注意的是，在JEB-R635^*中，Clitocine处理后LAMB3 mRNA水平显著增加（log₂[fold-change] 1.41，padj < 2.04E-74），同时83个参与细胞外基质组织、细胞黏附、转化生长因子-β信号、伤口愈合、细胞骨架组织和角质化的基因网络受到调控。在JEB-LAMB3细胞中，缺乏LAMB3时，21个经GO（Gene Ontology，基因本体）分类到细胞外基质组织、细胞黏附、细胞-基质黏附、伤口愈合和细胞迁移的基因较NHKs显著上调。STRING网络分析显示，通过Clitocine介导通读恢复LAMB3链后，这些基因mRNA水平下调并重建关键生物网络。与JEB-LAMB3角质形成细胞活力改善一致，衰老相关分泌表型、细胞对饥饿反应和NMD相关基因下调。与Clitocine处理后NHK细胞活力明显下降一致，242个经GO分类到细胞外基质组织、脂肪酸代谢、葡萄糖代谢、先天免疫系统、NMD通路、翻译后蛋白修饰、翻译后蛋白磷酸化、核糖体扫描和起始密码子识别、NOTCH信号和翻译起始复合物形成的基因网络，仅在Clitocine处理NHKs中下调，而未在JEB-R635^*中相对于载体处理对照下调。

细胞对Clitocine治疗的差异反应（Differential Response of Cells to Clitocine Treatment）：研究人员观察到，在JEB-R635^*细胞中产生最高恢复LAMB3链量的2.7 μM Clitocine对NHKs有强负面影响。因此，研究人员重新考虑最初追求最高蛋白恢复的目标，评估递增Clitocine浓度在六天培养中对NHKs、JEB角质形成细胞和成纤维细胞的影响。JEB-R635^*在所有Clitocine浓度下均生长良好、数量增加并保持贴壁；NHKs则变圆、脱落并最终死亡。JEB-R42^*R635^*和成纤维细胞也在2.7 μM Clitocine处理后六天失去典型形态并从培养皿脱落。这些结果提示细胞对Clitocine反应不同，2.7 μM Clitocine在较长培养期对多种细胞类型有毒性。较低浓度Clitocine在长期培养中似乎更安全，但这一优势以较低通读疗效为代价。

讨论部分总结：本研究识别Clitocine为JEB-LAM332最常见无义突变的通读药物。相反，其他在双荧光素酶报告实验中鉴定的药物ATZ、ART或ERY在患者来源角质形成细胞中未显示通读效应。Clitocine处理增加LAMB3链表达，通过改善细胞黏附和存活对JEB-R635^*产生正向影响。该效应在2.7 μM Clitocine时最明显，使JEB细胞中LAMB3链水平约为NHKs的10–30%。即使0.675 μM Clitocine也使LAMB3链水平增加约1–2%并改善细胞黏附。免疫印迹中带强度比较受样本间大差异影响。Clitocine浓度滴定表明细胞毒性是该药物的重要问题，研究人员观察到治疗反应和药物诱导毒性存在显著个体间变异。类似变异也见于“正常”角质形成细胞和成纤维细胞，其基因表达和细胞行为呈供体依赖性差异；这种异质性可能受供体年龄、解剖来源部位和个体遗传背景等因素影响，从而产生不同分子特征。Clitocine天然存在于Clitocybe inversa以及其他蘑菇，如Lepista inversa和Leucopaxillus giganteus中。它是带有嘧啶环外氨基的腺苷核苷类似物，在RNA转录物中替代腺苷，可能经转化为三磷酸核苷，通过改变转录下游密码子-反密码子相互作用实现通读。Clitocine在转录期间掺入RNA替代腺苷，可能通过破坏真核释放因子1（eRF1，eukaryotic release factor 1）识别和促进近同源转运RNA解码，阻碍PTC处有效终止，从而增加PTC通读。该作用机制不同于氨基糖苷类，后者作用于核糖体促进误读，而Clitocine作用于转录本水平。然而，Clitocine与eRF3降解剂CC-90009组合未进一步增加蛋白量，可能由于机制不同。毒性关注和靶向递送/方案需求仍是Clitocine临床使用的关键挑战。结果显示其对全局基因表达的影响并非选择性，与2.7 μM Clitocine抑制细胞稳态一致。该药物细胞毒性效应在NHKs中最强。翻译起始复合物形成、翻译后蛋白修饰和蛋白磷酸化等重要细胞过程仅在Clitocine处理NHKs中下调，而未在JEB-R635^*中下调。总之，JEB角质形成细胞仅在药物效应持续时恢复至接近正常状态。JEB角质形成细胞受益于黏附改善，本研究中两个细胞系之间存在一些差异。细胞外基质相关基因调节、NMD下调、伤口愈合相关基因上调以及疾病相关基因表达逆转表明，Clitocine不仅促进翻译通读，还部分正常化疾病相关细胞通路，提示Clitocine作为局部应用在纠正JEB分子缺陷方面具有潜力。这些发现凸显Clitocine作为JEB靶向局部治疗剂的潜力，提供有意义的层粘连蛋白β₃链恢复和改善细胞功能，同时强调谨慎剂量优化以平衡疗效和安全性。原文作者为Rui Zhang、Haifa El Mabrouk、Cristina Has和Saliha Beyza Sayar。研究结论部分可译为：这些发现凸显了Clitocine作为JEB靶向局部治疗剂的前景，能够有意义地恢复层粘连蛋白β₃链并改善细胞功能，同时强调谨慎剂量优化以平衡疗效与安全性的重要性。