基于靶向途径挖掘的Demiguisin家族新型修饰六肽发现研究

《Communications Chemistry》：Targeted pathway mining reveals novel modified hexapeptides from the demiguisin family

　　

在发现来源于有毒鸟类相关的拟无枝酸菌（Amycolatopsis）菌株的含哌嗪酸（piperazic acid, Piz）六肽demiguisin A之后，研究人员旨在探究该天然产物家族的结构多样性与生物活性潜力。在此，研究人员利用来自Amycolatopsis sp. PS_44_ISF1的dmg生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster, BGC）作为途径挖掘探针，以搜寻demiguisin A的替代产生菌。全球搜索仅鉴定出另一株来源于土壤的Amycolatopsis sp. NBC_01488，其编码高度同线的生物合成途径。在模拟羽毛条件下，PS_44_ISF1相较于NBC_01488展现出增强的生长与代谢物生产能力。尽管存在系统发育基因组学距离，两株菌均产生共有代谢物，而NBC_01488产生更为丰富的demiguisins，从而得以分离出五个新型衍生物，其特征为两个Piz结构单元具有不同的羟基化模式以及甘氨酸截短。其中两个同系物对禽类病原体胞内分枝杆菌（Mycobacterium intracellulare）表现出强效活性，并对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）具有中等活性。这些发现表明，靶向途径挖掘指导了Piz修饰与具有前景的抗分枝杆菌活性的demiguisin同系物化学多样性的扩展。

靶向途径挖掘揭示Demiguisin家族新型修饰六肽的化学多样性与抗分枝杆菌活性

一、研究背景与科学问题

鸟类依赖行为、生理和化学防御等多重机制来应对环境中病原体和寄生虫的持续威胁。尾脂腺（uropygial gland, UG）分泌的尾脂油是鸟类表皮免疫的重要组成部分，支持羽毛维护和防水功能，同时该腺体也栖息着包括γ-和α-变形菌门（Pseudomonadota）及放线菌门（Actinomycetota）在内的多种微生物，这些微生物有助于羽毛防御。研究人员此前从有毒鸟类Pachycephala schlegelii的尾脂腺中分离出Amycolatopsis sp. PS_44_ISF1菌株，该菌株通过产生抗真菌大环内酰胺ciromicin A、共分泌的表面活性脂肽家族pachycephalamides以及高度修饰的六肽demiguisin A（1）等生物活性代谢物，直接参与鸟类的化学防御系统。

Demiguisin A的化学结构引起了研究人员的特别关注，因其序列Gly–β,γ-OH-Piz–Leu–Piz–DHPA–γ-c-Pro中含有非蛋白源性哌嗪酸（hexahydropyridazine-3-carboxylic acid, Piz）残基。由于Piz的环化结构赋予肽骨架显著的构象刚性，这一特性通常与增强的生物活性相关，包括抗癌、抗感染、抗寄生虫、抗转移和免疫抑制活性。鉴于demiguisin A高度修饰的结构特征及其多模块非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase, NRPS）依赖性生物合成的复杂性，研究人员假设demiguisin化合物家族的结构多样性可能比最初描述的更为广泛。为验证这一假设，研究人员结合靶向基因组挖掘与靶向代谢物谱分析，鉴定出土壤来源的Amycolatopsis sp. NBC_01488为潜在产生菌，并通过优化培养条件实现了新demiguisin衍生物的分离与结构解析，进而重新评估了其生物合成途径及对一系列细菌菌株的抗菌活性。

二、主要技术方法

研究人员采用多种关键技术手段开展研究：以dmg生物合成基因簇部分序列进行nBLAST搜索实现靶向基因组挖掘；利用antiSMASH V7.1进行全基因组生物合成潜力分析，并通过BiG-SCAPE V2.0与MiBIG V4.0数据库进行基因簇相似性网络构建；使用Type Strain Genome Server（TYGS）平台和FastANI进行系统发育基因组学与物种界定分析；采用clinker（CAGECAT）进行基因簇共线性比对；通过液相色谱-高分辨质谱联用（LC-HRMS/MS）结合GNPS分子网络、SIRIUS V6.1及Natural Product Atlas（NPAtlas）数据库进行代谢物谱分析与去重复化；利用核磁共振（NMR）波谱技术（包括1D和2D NMR）完成新化合物的结构解析；通过PARAS和PRISM 4工具预测腺苷酸化（A）结构域底物特异性；采用微量肉汤稀释法进行抗菌活性评估。样本队列来源包括鸟类来源的Amycolatopsis sp. PS_44_ISF1和土壤来源的Amycolatopsis sp. NBC_01488两株菌。

三、研究结果

基因组挖掘鉴定demiguisin编码生物合成基因簇

研究人员首先以PS_44_ISF1中完整的dmg生物合成基因簇序列进行nBLAST搜索，但公共数据库中未发现完全匹配的序列。随后对dmg BGC的各基因片段进行逐一查询，仅在Amycolatopsis sp. NBC_01488基因组中发现一个同源基因簇序列（dem）。TYGS系统发育基因组学分析显示，两株菌位于不同的Amycolatopsis系统发育分支，PS_44_ISF1与Amycolatopsis saalfeldensis DSM 44993最为接近，而NBC_01488与Amycolatopsis mongoliensis 4-36形成姐妹分支。FastANI分析表明两株菌均代表独特物种。antiSMASH和BiG-SCAPE分析显示多个BGC在四株菌中保守存在，而编码pachycephalamides和利福霉素样BGC的基因簇仅存在于PS_44_ISF1中。clinker比对显示dmg与dem BGC在核心NRPS区域具有高度共线性和序列一致性（>70%），表明两者可能具有共同的进化历史。

培养条件对demiguisin产生的影响评估

研究人员在富营养（PDB和PDA）、贫营养（M9）及羽毛基（FA和FMA）培养基上培养两株菌。角蛋白酶基因挖掘显示PS_44_ISF1含有更完整的KerA样和KerC样枯草杆菌蛋白酶同源物。羽毛降解实验证实鸟类来源的PS_44_ISF1在羽毛肉汤培养基上实现80%的羽毛降解，而土壤来源的NBC_01488未观察到降解。GNPS分子网络分析确认两株菌均产生demiguisin A（1）及五个未注释的新衍生物（2–6）。产量分析显示化合物1在所有条件下均为主要代谢物，PDA培养基产量最高，且土壤来源的NBC_01488在PDA上培养时化合物1的总丰度最高。共培养实验未显著改变demiguisin的产量或肽组成。

新含Piz肽的结构解析

研究人员利用NBC_01488在PDA平板上进行放大培养，通过固相萃取和反相高效液相色谱纯化，获得六个demiguisin化合物，包括已知的demiguisin A（1）和五个新同系物。综合1D/2D NMR和MS/MS碎裂分析，化合物2（demiguisin B）为Gly–γ-OH-Piz–Leu–Piz–DHPA–γ-c-Pro，与化合物1的差异在于第一个Piz残基为γ-单羟基化而非β,γ-双羟基化；化合物3（demiguisin C）为β,γ-OH-Piz–Leu–Piz–DHPA–γ-c-Pro，缺失C端甘氨酸；化合物4和5（demiguisin D和E）为位置异构体，分别为γ-OH-Piz–Leu–Piz–DHPA–γ-c-Pro和β-OH-Piz–Leu–Piz–DHPA–γ-c-Pro；化合物6（demiguisin F）为Piz–Leu–Piz–DHPA–γ-c-Pro，第一个Piz残基无羟基化修饰。

生物活性评估

抗菌活性测试显示，demiguisin A（1）对革兰氏阳性和阴性测试菌株均无活性（MIC >64 μg/mL），但对结核分枝杆菌H37Ra表现出弱活性（MIC 64 μg/mL）。化合物2对结核分枝杆菌表现出中等活性（MIC 16 μg/mL）。化合物1和2对胞内分枝杆菌（M. intracellulare）表现出强效活性（MIC 2 μg/mL），该菌属于鸟分枝杆菌复合群（MAC），与禽结核病相关。缺乏甘氨酸残基的衍生物4和6对胞内分枝杆菌活性较弱（MIC分别为32和64 μg/mL），而化合物3和5无活性（MIC >64 μg/mL）。所有化合物对人肝癌细胞系HepG2均未显示细胞毒性（IC₅₀ >37 μg/mL）。这些观察表明末端甘氨酸残基可能对维持抗分枝杆菌活性所需的生物活性构象或理化性质起重要作用。

demiguisin生物合成的比较分析

dem BGC区域约39.2 kb，编码26个开放阅读框，包括七个NRPS编码基因（demP1-P7）。四个核心NRPS基因demP1、demP2、demP5和demP7被初步分配编码六个腺苷酸化（A）结构域。PARAS预测肽序列为Pro–Pro–Pro–Pro–Leu–Gly，PRISM 4预测为Pro–Pip–Pro–Pip–Phe–Gly。关于甘氨酸特异性截短，demP7和dmgP7装载模块缺乏缩合（C）结构域，可能损害甘氨酸掺入并促进提前链释放或模块跳过，与跳跃模型一致。关于Piz残基的位点特异性羟基化，研究人员对四种细胞色素P450酶（HmtN、PlyA、DemCYP450和DmgCYP450）进行BLASTp分析和多序列比对，尽管序列同一性较低，但其注释和保守的基因组定位支持DemCYP450和DmgCYP450催化Piz位点特异性羟基化的假设。

四、结论

自1959年Hassall等人首次发现非寻常氨基酸Piz以来，已报道约140种含Piz的天然产物，主要来源于放线菌。本研究展示了基因组引导的相关生物合成途径探索如何同时发现改良的产生菌株和扩展的结构多样性。研究人员利用Amycolatopsis sp. PS_44_ISF1的dmg BGC作为探针，鉴定出编码dem BGC并能产生demiguisin的新菌株Amycolatopsis sp. NBC_01488，功能分析确定了栖息地特异性生长条件，并发现新鉴定的土壤来源菌株比鸟类分离株具有更高的产量。不同培养条件的探索使得检测和分离具有甘氨酸截短和仅一个Piz结构单元位点特异性羟基化特征的含Piz demiguisin衍生物成为可能。尽管PS_44_ISF1和NBC_01488之间存在显著的系统发育基因组学差异、不同的菌落形态以及来自地理和生态上不同环境的分离，但dmg和dem BGC的高度保守性表明维持该生物合成途径存在强烈的选择压力。demiguisin家族的扩展进一步丰富了Piz修饰的化学多样性以及具有前景的抗分枝杆菌活性的含Piz肽类化合物。