《Letters in Drug Design & Discovery》：Panax notoginseng saponins ameliorate hyperglycemia-induced renal tubular epithelial cell injuries through activating farnesoid X receptor signaling to inhibit lipid peroxidation
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背景：糖尿病肾病是终末期肾病的主要病因，目前有效的靶向治疗仍有限。肾小管上皮损伤日益被认为是糖尿病肾病进展的重要促进因素，并与高糖（HG）诱导的氧化应激、脂质代谢紊乱和脂质过氧化密切相关。三七总皂苷（PNS）已被证明对高糖诱导的肾损伤具有保护作用。法尼醇X受体
背景：糖尿病肾病是终末期肾病的主要病因，目前有效的靶向治疗仍有限。肾小管上皮损伤日益被认为是糖尿病肾病进展的重要促进因素，并与高糖（HG）诱导的氧化应激、脂质代谢紊乱和脂质过氧化密切相关。三七总皂苷（PNS）已被证明对高糖诱导的肾损伤具有保护作用。法尼醇X受体（FXR）是一种由胆汁酸激活、表达于肾小管和肾小球细胞的核受体，参与肾脏脂质代谢、氧化应激调节、炎症和细胞稳态。然而，PNS是否通过FXR相关信号保护肾小管上皮细胞免受高糖诱导的损伤尚不清楚。因此，本研究旨在探讨PNS在高糖暴露的HK-2肾小管上皮细胞中的保护机制，重点关注法尼醇X受体（FXR）/AMP活化蛋白激酶（AMPK）/内皮素-1（ET-1）信号和脂质过氧化。方法：将HK-2细胞暴露于30 mmol/L D-葡萄糖以建立高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤模型。用不同浓度的PNS处理后评估细胞活力，以确定最佳工作浓度。随后评估PNS对细胞形态、氧化应激、脂质过氧化、抗氧化相关指标和凋亡的影响。通过siRNA转染敲低FXR，以检查FXR/AMPK/ET-1信号是否参与PNS的保护作用。结果：在所测浓度中，50 μg/mL PNS显示出最显著的保护作用，与高糖组相比显著提高细胞活力（P < 0.001）。PNS降低了活性氧（ROS；P < 0.01）和丙二醛（MDA；P < 0.05）水平，提高了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平（均P < 0.01），并降低了细胞凋亡（P < 0.001）。PNS还增加了FXR表达（P < 0.01）和p-AMPK/AMPK比值（P < 0.05），同时降低ET-1表达（P < 0.05）。在FXR敲低后，这些保护作用显著减弱。结论：PNS减轻了高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤，可能通过FXR/AMPK/ET-1信号介导的脂质过氧化抑制实现。这些发现为PNS作为糖尿病肾病潜在治疗策略提供了实验证据，但仍需进一步的体内验证。试验注册：不适用。
糖尿病肾病（diabetic nephropathy）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病（end-stage renal disease）的主要病因。目前临床治疗主要依赖血糖和血压控制、肾素-血管紧张素-醛固酮系统阻断、钠-葡萄糖共转运体2抑制剂等，但并不能完全阻止所有患者的疾病进展。肾小管上皮细胞损伤已被认为是糖尿病肾病进展的重要驱动因素，而高糖（hyperglycemia, HG）诱导的氧化应激、脂质代谢紊乱和脂质过氧化在其中发挥关键作用。近年来，中药活性成分的肾脏保护作用受到广泛关注。三七总皂苷（Panax notoginseng saponins, PNS）是中药三七的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、降血糖和调血脂等作用，临床上已用于糖尿病肾病辅助治疗并显示出改善肾功能指标的潜力。法尼醇X受体（farnesoid X receptor, FXR）是一种胆汁酸激活的核受体，在肾小管和肾小球细胞中均有表达，参与调节肾脏脂质代谢、氧化应激、炎症和细胞稳态。已有研究表明，FXR表达异常与糖尿病肾病进展密切相关，而PNS可能通过调节FXR相关信号发挥肾保护作用。然而，PNS是否通过FXR/AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）/内皮素-1（endothelin-1, ET-1）信号通路抑制脂质过氧化从而改善高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤，尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，以高糖暴露的HK-2人肾小管上皮细胞为体外模型，探讨PNS的保护作用及潜在分子机制。
研究人员将HK-2细胞暴露于30 mmol/L D-葡萄糖24小时建立高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤模型，并设置不同浓度PNS处理以确定最佳工作浓度。通过CCK-8法检测细胞活力，DHE荧光染色检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，ELISA检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平，流式细胞术检测细胞凋亡，免疫荧光染色观察磷酸化AMPK（p-AMPK）和ET-1表达，Western blot检测FXR、AMPK、p-AMPK和ET-1蛋白表达。此外，通过siRNA转染敲低FXR，以验证PNS的保护作用是否依赖于FXR/AMPK/ET-1信号通路。细胞系为HK-2人肾近端肾小管上皮细胞系（购自武汉普诺赛生物科技有限公司）。所有实验均独立重复三次，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验。
结果一：50 μg/mL PNS显著改善高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。CCK-8结果显示，高糖处理显著降低HK-2细胞活力（P < 0.001），而不同浓度PNS处理均不同程度改善细胞活力，其中50 μg/mL PNS效果最显著（P < 0.001）。形态学观察显示，高糖组细胞密度降低并出现明显形态改变，而PNS处理后细胞形态明显改善。甘露醇渗透压对照实验排除了高渗因素的作用，证明高糖本身而非渗透压变化导致细胞损伤。
结果二：PNS显著降低高糖处理后HK-2细胞的脂质过氧化和凋亡水平。DHE染色显示，高糖组ROS水平显著升高（P < 0.01），PNS处理后显著降低（P < 0.01）。ELISA结果显示，高糖组MDA水平显著升高，而SOD、CAT、GSH-Px水平显著降低（均P < 0.001）；PNS处理显著逆转这些变化（P < 0.05或P < 0.01）。流式细胞术显示，高糖组细胞凋亡率显著上升（P < 0.001），PNS处理后显著下降（P < 0.001）。
结果三：PNS通过调节FXR表达改善高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。RT-qPCR和Western blot证实，PNS可显著上调高糖条件下HK-2细胞中FXR的mRNA和蛋白表达（P < 0.001）。使用FXR siRNA敲低FXR后，PNS对细胞活力、ROS、MDA、SOD、CAT、GSH-Px水平以及凋亡的改善作用均被显著削弱，表明PNS的保护作用依赖于FXR表达。
结果四：PNS通过调节FXR/AMPK/ET-1介导的脂质过氧化改善高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。免疫荧光染色显示，高糖抑制p-AMPK表达并促进ET-1表达，PNS处理可逆转这些变化（P < 0.001和P < 0.01），但在FXR敲低细胞中PNS的上述调节作用消失。Liperfluo脂质过氧化检测显示，高糖组荧光强度显著增加（P < 0.001），PNS处理后显著降低（P < 0.01）。Western blot结果进一步证实，PNS显著提高FXR蛋白表达（P < 0.01）和p-AMPK/AMPK比值（P < 0.05），同时降低ET-1蛋白表达（P < 0.05），而FXR敲低后这些效应均被消除。
讨论部分总结：本研究表明，PNS通过激活FXR/AMPK/ET-1信号通路抑制脂质过氧化，从而减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。FXR在肾脏中高表达，而糖尿病肾病患者肾组织中FXR表达显著降低，提示FXR异常与糖尿病肾病发病密切相关。PNS通过上调FXR、增强AMPK磷酸化、抑制ET-1表达，降低ROS和MDA水平，恢复抗氧化酶活性，最终减少脂质过氧化相关损伤。由于脂质过氧化是铁死亡（ferroptosis）的核心生化事件，本结果提示PNS可能参与调控铁死亡，但实验未直接检测铁死亡标志物（如GPX4、SLC7A11、ACSL4、FTH1、4-HNE等），也未使用铁死亡特异性抑制剂进行挽救实验，因此不能推断PNS直接抑制铁死亡。研究局限性包括：体外实验无法完全模拟体内复杂微环境，未进行动物模型验证；未做葡萄糖剂量-时间反应优化；缺乏阳性药物对照；未使用AMPK抑制剂或挽救实验直接验证AMPK的介导作用；未区分内皮素受体亚型A和B的作用。未来需通过动物模型、原代细胞、通路特异性干预等手段进一步验证。
结论：本研究证明PNS可减轻高糖诱导的HK-2肾小管上皮细胞损伤，改善细胞活力，降低氧化应激和脂质过氧化相关改变，恢复抗氧化指标，减少凋亡。机制上，这些保护作用可能与激活FXR相关信号、增强AMPK磷酸化、抑制ET-1表达以及减少脂质过氧化相关细胞损伤有关。FXR敲低可削弱PNS的保护作用，支持FXR/AMPK/ET-1信号轴的参与。该研究为PNS在糖尿病肾小管上皮损伤中的潜在保护作用提供了体外实验证据，但仍需动物模型、原代肾小管上皮细胞以及通路特异性干预实验进一步验证。
