快速魔角旋转固体核磁共振解析依非韦伦（EFV）：芳香碳C3/C4归属校正与晶胞分子不对称性诊断

《Magnetic Resonance Letters》：Fast-MAS solid-state NMR of efavirenz: Insights into spectral assignments and molecular asymmetry

　　

固态核磁共振（solid-state nuclear magnetic resonance, NMR）波谱学是表征药物固体的有力技术，但谱峰归属的不一致性可能阻碍准确的结构解析。在本研究中，研究人员通过采用37 kHz的快速魔角旋转（magic-angle spinning, MAS），重新考察了广泛使用的抗HIV药物依非韦伦（efavirenz, EFV）的固态NMR。通过结合一维（¹H、¹⁹F、¹³C）和二维相关（¹³C–¹H与¹³C–¹⁹F）实验，研究人员解决了此前存在争议的归属。关键的是，研究人员校正了芳香C₃和C₄共振的误归属；该校正通过二维¹³C–¹H相关谱中关键的H_N-C₄邻近关系得到明确证实。¹⁹F谱显示两个不同峰，积分比为1:2，直接反映晶胞中三个晶体学独立分子，并为分子不对称性提供简便诊断。¹⁹F检测的¹³C–¹⁹F相关进一步区分碳环境。该工作不仅纠正了此前的归属错误，还建立了一种稳健的多核方法，整合¹H、¹³C和¹⁹F NMR，用于氟化药物的详细分析。

药物固体常呈现多晶型（polymorphism）、部分结晶和局部无序，这些因素会影响活性药物成分（active pharmaceutical ingredient, API）的稳定性、溶解度和生物利用度。X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）可用于确定长程晶体有序，但在检测局部结构变异、分子动力学和无序组分方面存在固有局限。固态核磁共振（solid-state nuclear magnetic resonance, NMR）能够提供原子级分子构象以及分子内和分子间相互作用信息，与XRD互补，因此在药物综合表征中具有关键作用。依非韦伦（efavirenz, EFV）是一种非核苷类逆转录酶抑制剂，仍是HIV一线治疗的中坚药物，并被列入世界卫生组织（World Health Organization, WHO）基本药物目录。EFV分子含有-NH和C=O基团，可形成氢键，因而具有丰富的固相化学和多种晶体堆积模式；迄今已发现超过23种不同的多晶型、溶剂化物和无定形相，使其成为固态NMR深入研究的理想对象。

既往¹³C交叉极化/魔角旋转（cross-polarization/magic-angle spinning, CP/MAS）研究已用于EFV研究。Gomes等观察到EFV与拉米夫定物理混合时固态NMR化学位移变化，提示两药不相容；该结果由差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）和热光学分析（thermo-optical analysis, TOA）提示，但傅里叶变换红外光谱（Fourier-transformed infrared spectroscopy, FT-IR）未显示。其谱图在4 kHz MAS下采集，分辨率有限且受旋转边带严重干扰。Fandaruff等研究EFV两种无水多晶型（form I和II），发现form I的¹³C谱共振数目多于form II，与不对称单元中存在三个分子一致；其在相对低磁场（300 MHz）下观察到源于四极核（¹⁴N和³⁵Cl/³⁷Cl）残留偶极耦合的线宽，并用CP和非季碳抑制（non-quaternary suppression, NQS）给出尝试性归属。然而，后续研究表明，其对三氟甲基（-CF₃）和大多数芳香碳（除C₃外）的归属仍模糊或似有误。Sousa等随后对经不同处理程序的EFV样品开展更全面研究，使用¹³C固态NMR以及¹H、¹³C和二维¹³C–¹H溶液NMR重新考察归属差异，尤其根据特征性¹³C–¹⁹F J分裂将C₁₄共振校正至123.2 ppm。然而，其对C₃和C₄的归属与其自身密度泛函理论（density functional theory, DFT）计算化学位移相矛盾，使这些具体归属仍未解决。基于已有归属，Szell等用变温和弛豫实验并结合DFT研究EFV及其系列共晶动力学，发现EFV-L-脯氨酸共晶中环丙基运动显著受限。Braga等用¹³C谱探索γ-环糊精对EFV溶解度的影响。Yadav等表征EFV-烟酰胺共晶，报道所有碳原子相对纯EFV的峰位移，其中C₆最大位移为1.28 ppm。尽管已有大量努力，文献中仍存在不一致，尤其是EFV form I芳香碳C₃和C₄的归属。先前归属似乎主要基于溶液NMR，缺乏充分的固态NMR验证；一维谱通常不足以明确归属芳香碳，多核相关实验对于确定性谱图解析必不可少。因此，研究人员在37 kHz相对快速MAS下对EFV form I开展综合固态NMR研究，除常规¹³C实验外，还获取高分辨¹H和¹⁹F谱，并采用二维¹³C–¹H和¹³C–¹⁹F相关实验解决此前归属歧义。具体而言，研究人员利用空间邻近的¹³C–¹H相关校正C₃和C₄误归属，并证明¹⁹F谱可简单、定量地测量晶胞内分子不对称性。该研究不仅细化EFV结构描述，也展示了一种在快速MAS下用多核固态NMR研究氟化药物的通用方法。

关键技术方法概括如下：样品为购自Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.的EFV form I粉末（CCDC 767883），约6 mg装入1.6 mm转子。所有固态NMR实验在Bruker AVANCE NEO 600 MHz（14.1 T）谱仪上完成，MAS频率为37.037 kHz；采用¹H–¹³C和¹⁹F–¹³C交叉极化（CP）、长/短接触时间一维¹³C CP/MAS、¹H和¹⁹F一维谱、二维¹³C–¹H与¹³C–¹⁹F异核相关、¹⁹F反转恢复测量纵向弛豫时间（T₁），并以溶液¹H NMR辅助。化学位移分别以金刚烷和三氟乙酸铵为参照。

3.1. ¹H、¹³C与二维¹³C–¹H谱
研究人员首次报道EFV固态¹H谱。该谱分辨率虽低于溶液谱，但可清晰区分质子类型：酰胺质子（H_N，9.2 ppm）、芳香质子（7.0–8.0 ppm）和环丙基质子（?0.3–1.6 ppm）。9.2 ppm共振基于其典型低场化学位移及其与CDCl₃中EFV溶液¹H NMR谱的接近对应关系归属为H_N；其余共振可参照溶液NMR归属。值得注意的是，亚甲基质子（H₁₂/H₁₃）在固态中相较溶液约0.9 ppm发生高场位移至?0.3 ppm，作者将其归因于晶体内分子间环电流效应。长接触时间（2 ms）¹H–¹³C CP谱显示所有碳，且因600 MHz更高磁场而较既往报道分辨率改善；短接触时间（0.05 ms）CP选择性增强质子化碳，显示芳香C₅、C₆和C₈强信号，而质子化C₁₁、C₁₂和C₁₃信号相对较弱，这与晶体结构中环丙基的高迁移性一致。¹⁹F–¹³C CP强烈增强靠近氟的碳，如三氟甲基（-CF₃）碳C₁₄（123.1 ppm）和C₂（79.6 ppm）。重要的是，C₁₄在¹H–¹³C谱中因¹³C–¹⁹F J耦合呈清晰四重峰，但在同时¹H和¹⁹F去耦下坍缩为单峰，从而确认其归属；此前文献中C₁₄曾被误归属至114.6 ppm或128.0 ppm。

芳香碳C₃和C₄的归属长期不一致。早期报道将134.3/134.9 ppm峰归为C₃、114.4 ppm归为C₄，似基于溶液HMBC数据；但这些解释可疑，因为其与自身DFT计算矛盾，后者预测C₃在121.4/123.0 ppm、C₄在138.4/138.9 ppm，且δ_C4–δ_C3大于15 ppm。为消除歧义，研究人员采集二维¹³C–¹H异核相关谱，使用0.8 ms CP接触时间观察H_N与邻近碳的相关。H_N与C₁在(147.5, 9.2) ppm出现强相关，对应已知分子内距离1.9 ?；在(134.5, 9.2) ppm也出现明显相关，研究人员依据分子内距离2.0 ?将其归为C₄–H_N相关。相较之下，C₃–H_N距离为3.2 ?，使相应交叉峰显著更弱甚至不可检测。虽然C₁和C₄都靠近H_N，但可通过其充分分离的¹³C化学位移范围和交叉峰强度差异区分；C₁仅靠近H_N，而C₄同时靠近H_N和H₅（距离均为2.0 ?），因此第二次CP步骤中C₄磁化分布在C₄–H_N和C₄–H₅路径，使C₄–H_N交叉峰弱于C₁–H_N交叉峰。C₄确定后，芳香碳中仅剩C₃和C₇；C₅、C₆和C₈为质子化碳并由短CP识别，C₇与Cl相连因而出现在更大化学位移处，因此C₃可归属在约114 ppm。该归属还得到¹⁹F–¹³C CP中C₃信号更强的支持，因为C₃比C₇更接近-CF₃基团。由此，这些实验明确确立134.5/135.3 ppm碳峰属于C₄，而114.5/114.8 ppm碳峰属于C₃，从而纠正早先文献归属。三维图神经网络快速预测将C₄置于137.2 ppm、C₃置于119.2 ppm，与实验归属一致；此外，¹⁴N编辑技术也可确认C₃和C₄归属，但需要¹H–¹³C–¹⁴N三共振探头。600 MHz下增强的分辨率还揭示若干碳的分裂（C₁、C₄、C₅、C₈、C₉、C₁₀和C₁₁-C₁₃），研究人员将其归因于不对称单元中三个晶体学不等价分子的存在。二维¹³C–¹⁹F归属进一步给出不同¹⁹F位点下部分碳环境差异，例如C₁在147.2、147.5、147.8 ppm，C₃在114.5、114.8 ppm，C₄在134.5、135.3 ppm，C₁₄在123.1 ppm等。

3.2. ¹⁹F与二维¹³C–¹⁹F谱
对于氟化化合物，¹⁹F NMR具有高灵敏度（与¹H相当）和来自辅料的可忽略背景，因此适合定量。EFV的¹⁹F谱在不到1分钟内采集，信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）超过2200，显示两个分辨良好的峰，分别在?81.5和?82.6 ppm。峰A和B/C的¹⁹F T₁值分别测定为0.56±0.03和0.55±0.03 s。两峰积分比为1:2，与Szell等报道一致，直接反映不对称单元中存在三个晶体学独立分子，为分子不对称性提供简单快速的¹⁹F NMR验证。此处A、B、C仅作为晶胞中三个分子的标签，不应被理解为与晶胞中特定位置分子一一对应。Szell等还证明DFT计算预测¹⁹F化学位移差小于0.5 ppm；尽管该差异在一维¹⁹F实验谱中无法分辨，但可在二维¹³C–¹⁹F相关谱中揭示。

二维¹³C–¹⁹F相关谱采用¹⁹F检测脉冲序列采集。由于¹⁹F相对¹³C具有更高旋磁比（γ_F/γ_C≈3.74），在考虑50% ¹³C–¹⁹F转移效率时，¹⁹F检测固有地提供约3.6倍于¹³C检测的灵敏度优势。类似的¹⁹F检测¹³C–¹⁹F TEDOR实验此前已用于¹⁹F标记GB1的距离测量；然而对于相关实验，CP预计比TEDOR对¹³C–¹⁹F对提供更高效率，更适合快速MAS条件。二维¹³C–¹⁹F谱进一步分辨每个¹⁹F位点的碳环境。例如，C₁₄（-CF₃）与两个¹⁹F峰相关，对构象A和B/C显示略有不同的化学位移（123.2 vs. 123.0 ppm）；同样，C₂、C₃、C₄、C₈和C₉显示分辨的相关，能够将部分峰归属至特定构象。涉及环丙基碳的某些相关未观察到，且有限SNR阻止所有碳的完全归属。尽管如此，二维谱提供有价值的补充信息，确认¹⁹F环境与衍射推导的不对称单元匹配，并有助于区分不同构象的碳。?82.6 ppm的¹⁹F峰分裂为约?82.5和?82.7 ppm两个共振，观测分裂约0.2 ppm，与Szell等报道的DFT计算定性一致，该计算也预测两个构象对应两个不同¹⁹F共振，尽管计算得到的¹⁹F化学位移差略大。该分裂在一维谱中未分辨。总体而言，¹⁹F检测二维¹³C–¹⁹F相关实验为构象依赖环境提供敏感探针，补充一维NMR、晶体学和DFT数据。

讨论部分总结：本研究中，二维¹³C–¹H和¹³C–¹⁹F相关谱为分析EFV提供良好基础。进一步实验，如二维¹H–¹⁹F和三维¹⁹F–¹⁹F–¹H相关，可能提供长程约束和分子构象的额外信息；这些在未来更快MAS频率下值得开展。

研究结论翻译：该工作提供了在快速MAS（37 kHz）下EFV form I的改进固态NMR归属。研究人员首先通过二维¹³C–¹H实验中直接检测到的C₄–H_N邻近，明确重新归属了芳香C₃和C₄共振。该归属与结构距离和计算预测一致，解决了文献中长期存在的矛盾。随后，研究人员利用两个具有1:2积分比的不同¹⁹F峰探测分子不对称性，这直接反映晶胞中存在三个独立分子。此外，二维¹³C–¹⁹F相关进一步区分了对应不同分子构象的碳环境，展示了¹⁹F检测实验用于快速和灵敏分析的能力。快速MAS与多核实验的综合使用，为氟化药物的详细固相表征提供了稳健策略，并与质量控制直接相关。