《Laboratory Investigation》：Comprehensive Molecular and Clinicopathological Profiling of Lymphatic Malformations
编辑推荐：
目的：淋巴管畸形（LMs）是罕见的低流速血管畸形，常由体细胞性PIK3CA突变驱动。然而，PIK3CA突变在LMs发病机制中的作用尚未完全阐明。本研究对LMs进行了整合分析，以阐明PIK3CA突变与临床表现、组织病理学特征及分子特征之间的关联。
材料与方法：研
目的：淋巴管畸形（LMs）是罕见的低流速血管畸形，常由体细胞性PIK3CA突变驱动。然而，PIK3CA突变在LMs发病机制中的作用尚未完全阐明。本研究对LMs进行了整合分析，以阐明PIK3CA突变与临床表现、组织病理学特征及分子特征之间的关联。
材料与方法：研究人员回顾性分析了34例LM病例。使用定制基因面板进行靶向二代测序评估PIK3CA突变。同时评估了临床及组织病理学发现，并进行了免疫组织化学检测。对2例PIK3CA突变型LM病例进行了空间转录组学分析。
结果：在34例患者中，20例（58.8%）检出体细胞性PIK3CA突变。突变型与非突变型LM在临床变量（年龄、性别、病变部位）及大多数组织病理学参数方面具有可比性，但突变型LM更常表现为畸形血管的散在分布模式。畸形血管的微环境，包括纤维性间质、淋巴聚集及巨噬细胞，在两种突变状态下均普遍存在。免疫组织化学显示，LM中淋巴管内皮细胞（LECs）的PI3K/AKT/mTOR通路激活水平高于正常淋巴管，且与PIK3CA状态无关，尽管该通路通常由功能获得性PIK3CA突变激活。LM中磷酸化AKT水平随年龄增长显著升高。空间转录组学鉴定了PIK3CA突变型LM中LEC富集区域的10个上调基因。在上调基因中，调控胚胎期淋巴管生成的NFATC1在LM的LECs中高表达，提示钙调磷酸酶-NFAT通路可能参与LM发病机制。
结论：总体而言，无论突变状态如何，LMs共享关键致病特征。这项以LECs及其微环境为重点的详细分析，可能为阐明LM发病机制及其对靶向治疗的意义提供见解。
论文解读文章
一、研究背景与目的
淋巴管畸形（LMs）是罕见的低流速血管畸形，组织学上由大小不一、形态不规则、薄壁的淋巴管构成，内衬淋巴管内皮细胞（LECs），周围包绕纤维及脂肪间质，常伴有散在的淋巴聚集。LMs发病率约为1/4000至1/16000，多在出生时或2岁前发病。目前，mTOR抑制剂西罗莫司（雷帕霉素）已成为改善LM相关症状的新型治疗选择，因此PI3K/AKT/mTOR信号通路受到广泛关注。
遗传学层面，约60%至80%的散发性LM中存在PIK3CA功能获得性体细胞突变，该突变仅在LM病变内的LECs中被检出，提示LECs可能是LM发展的驱动细胞。已鉴定的PIK3CA热点突变包括p.E542K、p.E545K（外显子9，螺旋结构域）和p.H1047R（外显子20，激酶结构域）。然而，既往临床研究显示，PIK3CA突变的存在与否及变异类型与年龄、性别、病变部位等临床特征无显著关联，因此PIK3CA突变在LM患者中的意义尚未完全阐明。
近年研究提出，LM的发展可能涉及LECs与间质微环境的协调互作。关键淋巴管生成生长因子VEGF-C可能由成纤维细胞和免疫细胞等间质细胞分泌，其受体VEGFR3表达于LEC质膜上。旁分泌VEGF-C/VEGFR3信号可能促进LM过度生长，而LECs本身也分泌生长因子和细胞因子，反向影响微环境。因此，分析LM发病机制需同时关注LECs及其周围微环境。
本研究旨在通过整合分子与临床病理学分析，阐明PIK3CA突变状态与临床表现、组织病理学特征（包括微环境）、PI3K/AKT/mTOR通路激活及VEGFR3表达之间的关联，并利用空间转录组学刻画PIK3CA突变型LM中LECs的mRNA表达谱，以揭示LECs在LM发病中的贡献。
二、主要技术方法
研究人员回顾性分析了日本大阪大学医院病理档案中34例经手术切除的LM病例的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织标本。主要技术方法包括：（1）组织学与免疫组织化学分析：由两名病理医师盲法评估囊性类型、畸形血管分布模式、纤维化、淋巴聚集等组织学参数，并对α-SMA、CD68、p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1、p-S6K1、VEGFR3、NFATC1、VEGF-C进行免疫组化染色，采用H评分系统半定量评估表达水平；（2）分子遗传学分析：使用覆盖PI3K/AKT及RAS/RAF/MAPK通路相关基因（TEK、PIK3CA、AKT1、PTEN、KRAS、NRAS、HRAS、BRAF、MAP2K1）全部外显子的定制基因面板进行靶向二代测序；（3）空间转录组学：对2例PIK3CA突变型LM（分别携带E542K和H1047R突变）的FFPE切片进行Visium空间基因表达分析，由病理医师将斑点人工注释为畸形血管斑点、脂肪组织斑点和纤维组织斑点三类；（4）基因表达分析：利用公共数据库GEO（登录号GSE98742）中的微阵列数据，比较LM与正常淋巴管的NFATC1 mRNA表达水平。
三、研究结果
（一）PIK3CA突变状态**
对34例LM患者进行二代测序，在20例（58.8%）中检出体细胞PIK3CA突变，14例（41.2%）未检出突变。最常见的变异为p.E542K（n=5）和p.E545K（n=5），其次为p.H1047R（n=4），另有6例携带非热点变异（包括p.C420R和p.Q546K）。其他基因未检出致病性突变。
（二）临床特征
34例LM患者平均年龄10.8岁（范围0-69岁，中位4.5岁），男女比例为1:1。病变位于头颈部（29.4%）、四肢（38.2%）和躯干（32.4%）。突变型与突变阴性型LM在年龄、性别比例、病变部位及既往治疗状态方面均无显著差异。
（三）组织病理学特征
囊性类型（大囊型、微囊型或混合型）在突变型与突变阴性型之间无显著差异。与突变阴性型LM相比，突变型LM显著更常表现为畸形血管的散在分布模式而非聚集分布模式（P=0.03）。纤维化在95.0%的突变型LM（19/20）和78.6%的突变阴性型LM（11/14）中观察到。α-SMA阳性间质细胞（即活化成纤维细胞或肌成纤维细胞）在30.0%的突变型LM和42.9%的突变阴性型LM中观察到。淋巴聚集在45.0%的突变型LM和50.0%的突变阴性型LM中观察到。CD68阳性巨噬细胞在所有LM中均有不同程度分布，其浸润模式（弥漫型或稀疏型）在两种突变状态间无显著差异。除畸形血管分布模式外，其余组织病理学参数在突变型与突变阴性型之间均无显著差异。
（四）PI3K/AKT/mTOR通路成分及VEGFR3的表达
正常淋巴管中p-AKT和p-mTOR检测不到，下游效应分子p-4EBP1和p-S6K1呈散在低水平表达。总体而言，正常淋巴管中PI3K/AKT/mTOR通路成分的表达低于LM中的畸形淋巴管。突变型与突变阴性型LM之间各通路成分表达水平无显著差异。p-AKT表达与患者年龄呈正相关（r=0.473，P=0.004）。VEGFR3表达与突变状态、患者年龄及组织病理学特征均无显著关联。
（五）转录组学特征
空间转录组学在PIK3CAE542K突变型LM和PIK3CAH1047R突变型LM中分别注释了1528和951个畸形血管斑点、432和436个脂肪组织斑点、418和678个纤维组织斑点。标志基因验证显示，PROX1（LEC标志物）、ADIPOQ（脂肪细胞标志物）和COL1A1（成纤维细胞标志物）分别在相应斑点类型中显著富集。在两例LM中，分别鉴定出24和25个在畸形血管斑点中高表达的基因，其中10个基因在两种病变中共同上调：PROX1、NFATC1、CCL21、SULF2、THBD、KLF2、TFF3、SHC1、APP和SNCG。在独立公共数据集（GSE98742）中验证发现，NFATC1 mRNA在LM中的表达显著高于正常淋巴管（P=0.03），CCL21也呈现升高趋势。免疫组织化学证实，正常淋巴管LEC核中NFATC1呈阴性至极弱表达，而LM的LEC核中NFATC1呈强阳性表达，且NFATC1表达水平与VEGFR3表达水平呈正相关（r=0.452，P=0.007）。NFATC1表达与突变状态及PI3K/AKT/mTOR通路激活状态均无关联。空间转录组学还显示，VEGFR3 mRNA在畸形血管斑点中显著富集，VEGF-C和VEGFR3的空间表达模式大体重叠；免疫组化显示VEGF-C在畸形血管LECs中呈阴性至弱阳性染色，而巨噬细胞呈阳性染色。
四、讨论与结论
本研究发现PIK3CA突变检出率（58.8%）及变异分布与既往大规模分析一致。临床特征与突变状态无显著关联，但突变型LM更常表现为畸形血管的散在分布模式，可能与PIK3CA突变驱动的LEC增殖和迁移增强有关。纤维性间质、淋巴聚集和巨噬细胞等被认为参与VEGF-C/VEGFR3信号的微环境成分在LM中普遍存在且与突变状态无关，VEGFR3在LECs中表达亦与突变状态无关，支持LECs与微环境互作（如旁分泌VEGF-C/VEGFR3信号）参与LM发展的假说。VEGF-C在LECs和巨噬细胞中的表达提示自分泌或旁分泌VEGF-C/VEGFR3信号可能参与LM发病。
本研究首次报道了LM中LECs的空间转录组学特征。NFATC1在LM的LECs中呈强核表达，而在正常淋巴管LECs中缺失或弱表达。NFATC1在胚胎淋巴管生成中发挥重要作用，其表达受PROX1调控，核转位可由VEGF/VEGFR信号或流动剪切应力诱导，且NFATC1的组成性激活可上调包括VEGFR3在内的淋巴管相关基因。NFATC1表达与VEGFR3表达的正相关与上述机制一致。NFATC1在LECs中的激活与PIK3CA突变状态无关，提示钙调磷酸酶-NFAT通路可能独立参与LM发病，值得作为潜在治疗靶点进一步研究。
PI3K/AKT/mTOR通路成分的激活与突变状态无关，但在LM中均高于正常淋巴管，部分支持西罗莫司对大多数患者（无论PIK3CA突变状态如何）的临床疗效。p-AKT表达随年龄增长而升高，可能提示年龄相关的AKT激活可通过mTOR以外的下游靶点影响LM发病，从而部分解释西罗莫司在年龄较大患者中反应性降低的临床观察。
研究结论：本研究的分析表明，LM的组织病理学特征可能因PIK3CA突变状态而异，但无论突变状态如何，LM共享关键致病特征，包括相对于正常淋巴管的PI3K/AKT/mTOR信号激活以及LECs中显著的NFATC1激活。这项以LECs和微环境为重点的详细分析，为阐明LM发病机制提供了见解，并可能为未来识别潜在治疗靶点提供机会。
