从单细胞测序数据分析到功能验证：XCL1 与口腔鳞状细胞癌中的糖酵解代谢相关

《Journal of Stomatology Oral and Maxillofacial Surgery》：From Single-Cell Sequencing Data Analysis to Functional Validation: XCL1 is Associated with Glycolytic Metabolism in Oral Squamous Cell Carcinoma

摘要目标
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一种发病率和死亡率较高的头颈部癌症。糖酵解代谢在其进展中起着关键作用，但调节 OSCC 中糖酵解的分子机制尚不清楚。

设计
使用 GSE247582 数据集的单细胞 RNA 测序来鉴定细胞亚群，分析代谢通路富集，并筛选核心候选基因。使用 TCGA 数据验证基因表达。进行体外功能获得和缺失实验以及糖酵解抑制实验，以评估 XCL1 对细胞增殖、凋亡和糖酵解相关代谢参数的影响。

结果
鉴定出五个细胞亚群，每个亚群具有不同的代谢特征。糖酵解/糖异生通路在特定亚群中显著活跃。通过差异表达分析鉴定出 15 个候选基因，其中 7 个在配对和非配对 TCGA 分析的 OSCC 组织中均显著上调。在验证的候选基因中，XCL1 显示出最显著且一致的上调，因此被选中进行功能研究。XCL1 敲低显著抑制了 OSCC 细胞增殖，诱导凋亡，并降低了葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP 水平、LDH 活性以及包括 HK2、PKM2 和 LDHA 在内的糖酵解酶的表达。相反，XCL1 过表达增强了 OSCC 细胞增殖和糖酵解相关代谢参数并减少了凋亡，而 2-DG 减弱了这些效应。

结论
XCL1 与体外糖酵解相关代谢改变和 OSCC 细胞生长有关。这些发现支持对 OSCC 中 XCL1 的进一步研究，同时需要体内研究和更大的临床队列来进一步评估其生物学和治疗意义。

引言
口腔鳞状细胞癌（OSCC）占口腔恶性肿瘤的 90% 以上，是全球范围内高发性且致命的癌症形式 [1]。尽管过去几十年在 OSCC 治疗方面取得了显著进展，但五年生存率仍低于 60% [2]。口腔鳞状细胞癌的主要危险因素包括咀嚼槟榔、吸烟和饮酒。这些不健康习惯对疾病的发生发展有显著贡献 [[3], [4], [5]]。在东南亚和南亚等地区，口腔鳞状细胞癌的发病率显著高于全球平均水平。它已成为这些地区的主要公共卫生问题。尽管诊断和治疗（包括放射治疗和化学治疗）取得了进展，但患者的五年生存率仍低于 50% [6]。了解 OSCC 的分子基础是发现新治疗方法的关键一步。

肿瘤代谢重编程是指肿瘤细胞在长期进化过程中产生的适应性代谢变化，涉及对其自身代谢通路的系统性重塑，以满足快速增殖、生物合成和适应微环境压力的需求。癌症的标志性特征之一是瓦博格效应，即肿瘤细胞即使在氧气充足的情况下，也优先通过糖酵解而非氧化磷酸化产生能量，反映了深刻的代谢转变 [7,8]。这种代谢重塑不仅为肿瘤细胞提供能量支持，还深度参与调节细胞增殖、存活、迁移和耐药性等关键生物过程。作为肿瘤的重要特征，它也成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶点。值得注意的是，糖酵解在多种癌症的进展中起着关键作用，如胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌和 OSCC [[9], [10], [11]]。具体而言，已知失调的糖酵解已被确认为 OSCC 中肿瘤生长和转移的关键驱动因素 [12,13]。先前的研究开始揭示 OSCC 中免疫相关信号与代谢重编程之间的联系。例如，免疫调节蛋白 B7-H3 被证明通过激活 PI3K/Akt/mTOR–HIF-1α 通路增强 OSCC 细胞的葡萄糖摄取和乳酸产生，从而促进有氧糖酵解和肿瘤生长 [14]。此外，对 OSCC 肿瘤微环境的研究表明，趋化因子信号有助于免疫细胞募集和肿瘤 - 基质相互作用，其中 CXCL12 等趋化因子涉及代谢改变的基质细胞与免疫细胞之间的通讯 [15,16]。然而，这些研究主要集中在单个免疫调节分子或特定趋化因子介导的微环境相互作用上，免疫趋化因子是否代表与 OSCC 糖酵解相关改变相关的分子决定因素仍缺乏表征。因此，系统性鉴定 OSCC 和糖酵解相关候选分子可能有助于揭示 OSCC 中趋化因子相关信号与代谢重编程之间先前未被认识的联系。

为了解决这一知识空白，本研究整合了单细胞转录组分析、癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析和体外功能实验，以系统鉴定和评估与 OSCC 糖酵解相关改变相关的候选分子。首先使用单细胞测序来表征 OSCC 组织内的细胞异质性和代谢通路谱，并筛选与 OSCC 和糖酵解相关特征相关的候选基因。随后使用 TCGA 数据对候选基因表达进行交叉验证，然后在正常口腔上皮细胞和 OSCC 细胞系中进行实验验证。然后利用基因功能获得和缺失方法以及糖酵解抑制剂 2-脱氧葡萄糖（2-DG）进行功能测定，以评估所选候选分子对 OSCC 细胞增殖、凋亡和糖酵解相关代谢参数的影响。通过这种整合筛选和验证策略，我们旨在鉴定并功能评估与 OSCC 糖酵解改变相关的潜在分子决定因素。

部分摘录
数据来源
OSCC 患者的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据来自基因表达 omnibus 数据库（GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），登录号为 GSE247582。该数据集包括三名 OSCC 患者的单细胞转录组，用于探索性表征细胞异质性和鉴定候选分子特征。

单细胞数据处理
使用集成多种分析方法的在线平台进行 scRNA-seq 数据分析（3838/trial/单细胞转录组数据的质量评估和细胞异质性）。GSE247582 数据集的单细胞 RNA 测序数据首先经过质量控制。测序深度、检测基因数和线粒体基因比例的可视化确证数据质量高，适合下游分析（图 1A）。为了识别最可变特征，对所有细胞进行了方差分析，得出前 2000 个高变基因，并标记了前 9 个最显著基因（图 1B）。三个样本的主成分分析。

讨论
癌症生物学的最新进展揭示了与肿瘤发生和化疗暴露相关的关键分子改变。这些分子认知正在推动针对涉及癌细胞生长、存活和化疗耐药性的特定分子的靶向治疗策略的开发。这些靶向方法显著提高了各种恶性肿瘤的总体生存率 [22]。因此，开发 OSCC 的靶向治疗具有。

结论
总之，本研究通过转录组筛选和功能验证，鉴定出 XCL1 是与 OSCC 糖酵解代谢相关的候选分子。XCL1 耗竭抑制了 OSCC 细胞增殖并增加了凋亡，伴随葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP 水平、LDH 活性以及包括 HK2、PKM2 和 LDHA 在内的糖酵解相关酶表达的降低，而 XCL1 过表达则产生相反效应。这些的调节。

伦理与参与同意
不适用。本研究使用了来自 GEO 和 TCGA 的公开且去标识化的人类转录组数据集以及商业可用细胞系。未收集新的人类样本，也未获取可识别的人类参与者信息。因此，不需要机构伦理批准和知情同意。

发表同意
所有作者均已阅读并批准最终手稿，并同意发表。

临床试验编号
不适用。

利益冲突
本文所有作者承诺没有个人利益冲突。

资助信息
本研究得到河北省医学科学研究项目（20250067）资助。

作者贡献
L. Z. 和 W. L. 对本工作贡献相等。L. Z. 构思和设计研究，执行方法论，进行正式分析，并撰写原稿。W. L. 开发方法论，实施软件，进行验证和数据整理，并撰写原稿。D. W. 提供资源并进行调查研究。L. W. 进行验证和正式分析。W. W. 协助可视化和调查研究。W. Z. 监督项目，管理。

数据可用性
支持本文结论的数据集可在基因表达 omnibus 数据库（GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取，登录号为 GSE247582。

CRediT 作者贡献声明
Liru Zhang：撰写 – 初稿，方法论，正式分析。
Wei Liu：验证，软件，方法论，数据整理。
Di Wang：资源，调查研究。
Luping Wang：验证，正式分析。
Wei Wang：可视化，调查研究。
Wenjuan Zhang：撰写 – 审阅与编辑，监督，经费获取。

利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些关系可能被认为会影响本文所报告的工作。

致谢
不适用。

Liru Zhang|Wei Liu|Di Wang|Luping Wang|Wei Wang|Wenjuan Zhang