《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Repurposing terazosin for ischemic stroke: Targeting the PTPN1/RAP1A pathway to restore neuronal mitochondrial function
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摘要
缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）仍是全球导致死亡和残疾的主要原因，针对缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤的有效治疗手段十分有限。药物重定位（drug repurposing）为快速临床转化提供了一条有前
摘要
缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）仍是全球导致死亡和残疾的主要原因，针对缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤的有效治疗手段十分有限。药物重定位（drug repurposing）为快速临床转化提供了一条有前景的途径。本研究旨在识别参与脑I/R损伤的关键调控靶点，并探索潜在的神经保护治疗药物。研究人员利用小鼠短暂性大脑中动脉闭塞/再灌注（transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型和细胞氧糖剥夺/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模型，结合多组学分析与计算筛选，鉴定出蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1，PTPN1）为关键调控因子。PTPN1在脑I/R损伤后神经元中显著上调，神经元PTPN1过表达可显著加重神经元损伤和神经功能缺损。在机制上，PTPN1通过酪氨酸去磷酸化增强Ras相关蛋白1A（Ras-related protein 1A，RAP1A）的活性，从而破坏I/R损伤后的神经元线粒体功能。此外，美国食品药品监督管理局（United States Food and Drug Administration，US FDA）批准的药物特拉唑嗪（terazosin，TZ）可直接结合PTPN1，抑制其活性，并通过促进SMAD泛素化调节因子1（SMAD ubiquitination regulatory factor 1，SMURF1）介导的泛素化降低其表达。因此，TZ可减轻神经元线粒体功能障碍，改善脑I/R损伤后的神经功能恢复。综上，本研究将PTPN1/RAP1A通路确立为脑I/R损伤的新型治疗靶点，并将TZ确立为一种具有潜在重定位价值的IS神经保护药物。
一、研究背景与意义
脑卒中是全球第三大死亡原因，其发病率和死亡率持续攀升。缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）的治疗窗口极为狭窄，仅少数患者能从再灌注策略中获益。尽管再灌注对于挽救缺血脑组织至关重要，但血流恢复可能反而触发脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤，导致继发性神经元损伤和神经功能障碍。因此，深入探究IS后细胞损伤的病理生理机制，并开发针对性神经保护疗法，是减轻缺血缺氧所致神经元损伤的关键。
线粒体在维持细胞能量代谢平衡和调控细胞命运中发挥核心作用。神经元需要大量能量维持正常生理功能，脑内相当比例的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）被神经元电活动消耗。IS发生后，脑血流减少导致氧和葡萄糖剥夺，损害有氧呼吸并诱发线粒体功能障碍；随后的再灌注进一步加剧氧化应激、线粒体损伤和神经元功能障碍。因此，线粒体是促进脑I/R损伤后神经元恢复的关键靶点。
蛋白酪氨酸磷酸酶非受体1型（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1，PTPN1）作为一种经典的非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，参与炎症、代谢调节、氧化应激和神经元损伤等多种病理过程。Ras相关蛋白1A（Ras-related protein 1A，RAP1A）作为下游小GTP酶信号分子，也被认为与IS相关细胞损伤有关。然而，PTPN1/RAP1A信号轴是否参与脑I/R损伤后神经元线粒体功能障碍尚不清楚。
特拉唑嗪（terazosin，TZ）是经美国食品药品监督管理局（US FDA）批准的选择性长效α1-肾上腺素能受体拮抗剂。近年研究表明，低剂量TZ具有神经保护特性，可改善多种神经退行性疾病动物模型的预后，且该作用独立于其对α1受体的影响。然而，TZ在脑I/R损伤中的治疗潜力及其分子机制仍不明确。
本研究通过多组学分析首次鉴定PTPN1为脑I/R损伤后显著上调的神经元靶点，深入探究其下游机制及治疗意义，并通过计算筛选发现低剂量TZ可抑制PTPN1/RAP1A信号轴活性，从而减轻神经元损伤、促进神经功能恢复。该研究为脑I/R损伤后神经元损伤的分子机制提供了更深入的理解，TZ有望成为靶向线粒体功能障碍的新型神经保护药物。论文发表在《Journal of Pharmaceutical Analysis》。
二、主要技术方法
研究人员综合运用了多种关键技术：定量蛋白质组学（tandem mass tag，TMT标记）分析MCAO/R小鼠缺血半暗带组织差异表达蛋白；利用公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（GSE227651，来自Zeng等）进行细胞类型特异性差异表达基因分析；通过疾病靶点数据库（DisGeNET、TTD、OMIM）检索IS相关靶点；采用计算机虚拟筛选（基于AlphaFold预测的PTPN1结构，筛选3443种US FDA批准药物）和分子对接（MOE2019）鉴定候选药物；表面等离子体共振（SPR）和细胞热位移分析（CETSA）验证药物与靶蛋白直接结合；体内实验采用C57BL/6J小鼠和Ptpn1敲除小鼠，建立MCAO/R模型，通过立体定位注射神经元特异性腺相关病毒（AAV）实现PTPN1过表达或敲低；体外实验采用HT22小鼠海马神经元细胞和HEK293T细胞，建立OGD/R模型；通过透射电子显微镜（TEM）、Seahorse细胞能量代谢分析、ATP含量检测、线粒体膜电位（JC-1染色）等评估线粒体结构与功能；通过免疫共沉淀（Co-IP）、Western blot（WB）、免疫荧光（IF）等验证蛋白相互作用与修饰。
三、研究结果
3.1 PTPN1在脑I/R损伤后神经元中显著上调
研究人员通过疾病靶点数据库检索获得1706个IS相关潜在靶点，MCAO/R小鼠缺血半暗带定量蛋白质组学分析鉴定出143个显著上调和16个下调蛋白，与数据库靶点取交集获得35个重叠靶点。进一步分析公共scRNA-seq数据集（GSE227651），神经元呈现最多差异表达基因（294个上调、57个下调），将这351个神经元特异性差异基因与35个候选靶点交叉分析，PTPN1（Ptpn1）是唯一共同基因。小提琴图和UMAP可视化显示Ptpn1表达在MCAO/R组显著升高且主要定位于神经元簇。IF和WB证实PTPN1在MCAO/R后12小时开始升高、24小时达峰，且主要表达于神经元。体外OGD/R模型同样验证了PTPN1表达上调。
3.2 神经元PTPN1过表达显著加重脑I/R损伤后神经元损伤和神经功能缺损
体外实验中，PTPN1过表达进一步降低OGD/R后HT22细胞活力（MTT法）。体内实验中，神经元特异性AAV介导的PTPN1过表达显著增加MCAO/R小鼠脑梗死体积（TTC染色），加重缺血半暗带神经元损伤（Nissl染色显示尼氏体密度降低），且尼氏体密度与PTPN1表达呈负相关（R2=0.8692）。行为学评估（mNSS、抓力、转棒、静态杆测试）显示PTPN1过表达显著阻碍神经功能恢复，第7天行为学结果与PTPN1表达水平呈负相关（R2=0.7107–0.9096）。
3.3 PTPN1通过去磷酸化RAP1A的Tyr40增强其活性
通过质谱鉴定PTPN1 pull-down蛋白，KEGG富集分析显示差异结合蛋白显著富集于Rap1、cAMP、Ras和MAPK信号通路，与scRNA-seq神经元差异基因富集通路重叠。RAP1A是四条通路共有的关键靶点，蛋白互作网络分析将其列为与PTPN1直接互作的首要候选。Co-IP证实PTPN1与RAP1A存在物理互作。PTPN1过表达不改变RAP1A表达水平但显著增强其GTP结合活性。PTPN1共表达显著降低RAP1A酪氨酸磷酸化水平，PTPN1特异性抑制剂PTP1B-IN-4可减弱该去磷酸化效应。通过GPS预测和定点突变实验，Y40F突变显著抑制PTPN1介导的去磷酸化，确认Tyr40为关键去磷酸化位点。PTPN1 C215A突变体丧失调节RAP1A活性的能力，表明Cys215为关键活性位点。
3.4 PTPN1通过下游RAP1A信号通路破坏脑I/R损伤后神经元线粒体功能
TEM显示PTPN1过表达加剧MCAO/R后神经元线粒体嵴断裂、平均线粒体长度缩短、每神经元线粒体数量减少、受损线粒体比例升高。PTPN1过表达进一步降低OGD/R后HT22细胞ATP含量和氧消耗率（OCR），包括最大呼吸和备用呼吸容量。神经元特异性PTPN1敲低（AAV-hSyn-shPTPN1）显著减小梗死体积、减轻神经元损伤和凋亡（TUNEL/NeuN双染）、改善线粒体形态和神经行为学结果，但这些保护效应均被RAP1A激动剂8-CPT-2'-O-Me-cAMP逆转。Ptpn1敲除小鼠呈现一致结果，同样可被RAP1A激动剂逆转。
3.5 TZ直接结合PTPN1并抑制其活性
利用US FDA批准药物库对PTPN1 Cys215位点进行虚拟筛选，TZ、罗哌卡因、碘塞罗宁、环吡酮和氯诺昔康为对接评分最高的五种化合物。酶活性检测显示TZ对PTPN1磷酸酶活性的抑制最为显著。分子对接显示TZ与PTPN1结合能为?7.02 kcal/mol，SPR证实TZ与PTPN1具有强结合亲和力（KD=0.325 μM）。生物素标记TZ（biotin-TZ）pull-down实验和IF染色验证了细胞内TZ与PTPN1的直接互作，CETSA显示TZ增加PTPN1热稳定性。C215A突变后TZ结合显著减弱（结合能?4.3 kcal/mol，pull-down信号明显降低），证实Cys215为TZ结合关键位点。TZ处理显著逆转OGD/R诱导的RAP1A活性升高。
3.6 TZ减轻脑I/R损伤后神经元损伤并促进神经功能恢复
剂量探索实验显示50 μg/kg（中剂量）和100 μg/kg（高剂量）TZ显著减小MCAO/R小鼠梗死体积，选择50 μg/kg用于后续实验。该剂量不影响MCAO/R后7天内血压变化，连续14天给药对心、肝、脾、肺、肾无明显毒性。TZ显著改善MCAO/R后14天内的神经行为学结果（mNSS、抓力、转棒、静态杆），减轻缺血半暗带尼氏体丢失和神经元凋亡。体外实验中，100 nM TZ处理24小时显著提高OGD/R后HT22细胞活力，减少凋亡。
3.7 TZ通过促进SMURF1介导的泛素化降低PTPN1水平
WB和IF证实TZ显著降低MCAO/R后缺血半暗带和OGD/R后HT22细胞中升高的PTPN1水平。苯氧苄胺（PBZ，不可逆α-肾上腺素能受体阻断剂）预处理不影响TZ降低PTPN1的作用，表明该效应独立于α1受体拮抗活性。CHX实验显示TZ加速PTPN1降解，MG132（蛋白酶体抑制剂）可逆转TZ对PTPN1水平的降低作用，提示TZ通过泛素-蛋白酶体途径促进PTPN1降解。TZ显著提高MCAO/R后脑组织和OGD/R后细胞中PTPN1的泛素化水平。通过UbiBrowser预测结合质谱数据，鉴定SMURF1为PTPN1潜在E3泛素连接酶，Co-IP证实SMURF1与PTPN1互作，SMURF1显著增强PTPN1泛素化。分子对接显示TZ可结合SMURF1 HECT结构域开放构象（9FSJ，评分?6.49），CETSA证实TZ与SMURF1存在直接互作。SMURF1抑制剂Smurf1-IN-A01处理可消除TZ对PTPN1泛素化的促进作用。
四、研究结论与讨论
本研究通过多组学整合分析，系统鉴定了PTPN1为脑I/R损伤后神经元中显著上调的关键调控因子。机制研究表明，PTPN1通过去磷酸化RAP1A的Tyr40位点增强其GTP结合活性，进而破坏神经元线粒体结构与功能，加重神经元损伤和神经功能缺损。PTPN1/RAP1A信号轴被确立为脑I/R损伤的新型治疗靶点。通过计算机虚拟筛选，研究发现US FDA已批准药物TZ可直接结合PTPN1的Cys215位点并抑制其酶活性，同时通过促进SMURF1介导的泛素化加速PTPN1蛋白降解，双重机制协同抑制PTPN1/RAP1A信号轴。体内外实验一致证实低剂量TZ可减轻神经元线粒体功能障碍、减少神经元凋亡、缩小梗死体积并促进神经功能恢复，且该作用独立于其经典的α1受体拮抗活性。TZ作为一种已获批药物，具有良好的生物安全性和临床转化前景，有望成为靶向线粒体功能障碍的IS神经保护治疗药物。该研究为IS的药物重定位策略提供了坚实的实验依据和新的研究方向。
