《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Leveraging high temperature for enhanced and faster detection of SARS-CoV-2 and its Omicron variant with CRISPR-AsCas12a
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•在高达65oC的孵育条件下，AsCas12a仍表现出稳定的跨切割活性。•在高温下，CRISPR-Cas12a能够更快且更敏感地检测DNA。•系统优化使我们能够在5分钟内区分SARS-CoV-2的不同变种。引言在SARS-CoV-2大流行期间，新的基于CRISPR的诊断方法应运而
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在高达65oC的孵育条件下，AsCas12a仍表现出稳定的跨切割活性。
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在高温下，CRISPR-Cas12a能够更快且更敏感地检测DNA。
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系统优化使我们能够在5分钟内区分SARS-CoV-2的不同变种。
引言
在SARS-CoV-2大流行期间，新的基于CRISPR的诊断方法应运而生，其病毒检测性能可与金标准PCR相媲美甚至超越[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]。特别是CRISPR-Cas系统结合等温核酸扩增技术，实现了与PCR相当的特异性和灵敏度，而且检测时间不到1小时，并可在现场（POC）使用[8], [9], [10]。其中一些方法获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的紧急使用授权（例如SHERLOCK CRISPR SARS-CoV-2试剂盒[11]）。然而，为了进一步提高CRISPR基分子诊断方法的效果，还需在减少检测时间、提高灵敏度和简化操作流程方面进行更多创新。
CRISPR-Cas12a（旧称Cpf1）是一种V型系统，已被用于检测SARS-CoV-2、其他病原体[2], [3], [4], [5], [6], [12], [13], [14], [15]，甚至哺乳动物细胞系中的基因突变[16]。它通过Cas12a蛋白与CRISPR RNA（crRNA）之间的相互作用形成核蛋白复合物（RNP），其中crRNA由重复序列（20个核苷酸）和可变序列（20-24个核苷酸）组成[17], [18]。crRNA可以被编程以特异性地检测互补的目标DNA序列，前提是这些序列位于PAM序列（TTTV）的3'端。识别到目标序列后，Cas12a会激活其核酸酶RuvC结构域，切割双链DNA。RuvC结构域持续活跃，还能切割单链DNA报告探针（即所谓的“跨切割”活性或附带活性），从而产生可检测的比色或荧光信号。
尽管CRISPR-Cas12a系统的检测限（LoD）据报道在皮摩尔（pM）范围内[13]，但根据酶-靶标对的催化效率模型，其LoD不可能低于100飞摩尔（fM）[19]。因此，单靠CRISPR-Cas12a难以检测到临床实际意义的SARS-CoV-2量[20]。环介导等温扩增（LAMP）[21], [22]可以在几分钟内指数级放大目标序列的数量，从而将CRISPR-Cas的检测灵敏度提高数个数量级[23], [24]。然而，LAMP需要在60至65°C的温度下运行，而CRISPR-Cas系统通常在37°C下进行，这导致需要使用两种不同的温度。消除这种温差限制将带来显著优势：它可以简化实验流程、减少所需设备数量和孵育步骤、加快检测速度、缩短获取结果的时间，甚至可能使LAMP和CRISPR-Cas反应并行进行。因此，找到一种简单的方法来解决这一温度限制问题，将对改进基于CRISPR的分子诊断方法的发展产生积极影响。
温度是影响酶活性和动力学的关键参数，直接关系到基于CRISPR的方法的准确性、效率、实用性、特异性和灵敏度。调整Cas蛋白工作的温度具有挑战性，因为它们通常只在较窄的温度范围内表现出最佳活性。本研究中使用的Cas12a的同源蛋白AsCas12a（来源于Acidaminococcus sp）被认为是非热稳定的。据报道，AsCas12a的熔解温度（Tm）约为40°C，与crRNA结合后升至约49°C或约54°C[25], [26]。其他常用的CRISPR诊断蛋白如LwaCas13a也是如此，其单体形式的Tm为45°C[27]。
为了解决温度不兼容的问题，研究小组寻找了Cas12a蛋白的热稳定同源蛋白[25], [27], [28]或设计了热稳定蛋白版本[29]。通过基因数据库筛选，发现了热稳定的Cme和YmeCas12a，它们的单体形式Tm分别为55°C和56°C，形成RNP后Tm分别升至61°C和65°C[25]。此外，一系列名为“SLK”的Cas12a同源蛋白的RNP Tm介于43°C至65°C之间[27]。还有报道指出，AacCas12b和AapCas12b的RNP Tm分别为56°C和63.4°C[30], [31]。Nguyen等人于2023年利用机器学习技术创建了一种高度热稳定的Cas12b蛋白版本，实现了CRISPR-Cas和RT-LAMP的联合应用[29]。不过，这些方法虽然有效，但需要大量资源和时间来寻找适用于所需温度的热稳定同源蛋白或对蛋白质进行精细工程改造。如果能找到更简单的方法，让CRISPR-Cas检测在更高温度下使用已知且特性明确的系统进行，将对CRISPR诊断领域带来很大帮助。
在本研究中，我们旨在探索野生型（wt）AsCas12a蛋白在高温下特异性检测DNA的条件，并利用这些条件来提高SARS-CoV-2的检测效果（见图1）。我们首先研究了孵育温度（高达65°C）对DNA检测速度的影响。出乎意料的是，我们发现CRISPR-AsCas12a在65°C下仍能检测到编码SARS-CoV-2 N基因的DNA（见图1B），速度比在30°C快8倍，比在37°C快3倍，且没有产生假阳性结果。在优化了65°C下的缓冲条件后，检测速度进一步提高了1.6倍（见图1C）。最终，通过结合最佳温度和缓冲条件，我们建立了一种使用荧光和侧向流动条检测SARS-CoV-2的两步方法，并证明了该方法能够区分Omicron变异株和野生型株（见图1D）。该流程通过临床样本验证，检测时间缩短至不到10分钟。这证明了无需改造热稳定蛋白版本，就能通过温度优化提升野生型CRISPR-AsCas12a的性能和速度，从而改进病原体检测。
章节片段
材料
醋酸钾、醋酸镁、NaCl、(NH4)2SO4、MnSO4、MgCl2、DTT、BSA、亚精胺、Triton?X-100、KCl、PEG-8000和L-脯氨酸均购自Sigma-Aldrich（美国马萨诸塞州伯灵顿）；tris、甘氨酸和 Tween 20购自Bio-Rad（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）；HCl和醋酸钠分别购自JT Baker（美国宾夕法尼亚州拉德诺）和Affymetrix-USB（美国加利福尼亚州圣克拉拉）。所有材料均为分析级质量。
crRNA和引物的合成
所有RT-LAMP引物、crRNA和报告探针均由我们自行合成。
高温对CRISPR-AsCas12a检测DNA的影响
首先，我们研究了温度对检测携带SARS-CoV-2核衣壳（N）基因的pDNA的RNP附带活性的影响（见图1）。我们假设，在高于报道的Tm（约45-50°C）[25], [26]的温度下孵育AsCas12a会对DNA检测产生负面影响。有两种可能的结果：（i）由于蛋白质变性，附带活性显著降低；（ii）附带活性完全消失。
结论
将CRISPR-AsCas12a反应温度升高至65°C后，附带切割活性得到增强，而不影响其稳定性，从而实现了更快速和特异的核酸检测。通过系统化的缓冲液优化，荧光信号强度提高了三倍，检测时间减少到了约7分钟。
资金来源
本研究得到了UNAM-PAPIIT（IV200820）的支持。
Mario Alanis Garcia：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据分析。Armando Hernandez-Garcia：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、资源协调、方法设计、实验设计、数据分析、概念构思。Erick Gustavo Valdés：实验研究。Idalia García：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据分析、方法设计、概念构思。Jessica
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的报告内容。
致谢
本工作得到了UNAM-PAPIIT（IV200820）和墨西哥外交与合作发展部（COVID项目）的支持。
Melissa Morales Moreno|Jessica Zacarias|Idalia García|Mario Alanis Garcia|Erick Gustavo Valdés|Armando Hernandez-Garcia
