氧化降解对皮下注射阿达木单抗生物利用度的影响

《Journal of Pharmaceutical Sciences》：Impact of oxidative degradation on the bioavailability of subcutaneously administered adalimumab

　　

氧化降解对皮下注射阿达木单抗生物利用度的影响

· AAPH和H₂O₂主要氧化阿达木单抗中的甲硫氨酸残基，其中H₂O₂处理观察到的氧化水平更高。
· 氧化导致构象稳定性降低、聚集倾向增加以及电荷变异体谱改变。
· 在两种氧化条件下，与新生儿Fc受体（FcRn）的结合亲和力均显著降低。
· 体内研究表明，氧化物种在皮下（SC）组织中的滞留时间比未氧化对照更长，但并非永久性。
· 构象稳定性降低（而非FcRn亲和力减弱）可能部分解释了药代动力学（PK）谱的变化，包括氧化物种在SC组织中滞留时间延长。

治疗性单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）已广泛应用于肿瘤、免疫介导性疾病等。约70%获批mAbs经静脉注射（IV）给药，约30%经皮下注射（SC）给药。SC给药可提高患者便利性，但mAbs从注射部位经淋巴管吸收，淋巴结中免疫细胞可产生活性氧（reactive oxygen species, ROS），导致不完全生物利用度（bioavailability, BA，通常为50–85%）。氧化可靶向甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）等易感氨基酸，进而影响抗体稳定性、生物活性及吸收动力学。然而，氧化对SC BA的影响迄今尚未充分研究。本研究以阿达木单抗（AdmAb）为模型，整合化学氧化、生物物理表征、FcRn结合分析和体内药代动力学评估，系统研究氧化降解对SC给药后抗体处置的影响。

研究人员采用AAPH或H₂O₂对AdmAb进行强制氧化，发现氧化主要发生在Fc区Met256和Met432，H₂O₂氧化水平更高。氧化降低构象稳定性（尤其CH₂域），增加聚集倾向，改变电荷变异体谱，并显著降低与人和大鼠FcRn的结合亲和力。体内研究表明，氧化物种在SC组织滞留时间延长但非永久性，总SC BA仅轻微下降。该研究首次系统揭示氧化降解对SC BA的潜在影响，提示构象稳定性降低可能部分解释PK变化，为预测和改善SC给药mAbs的BA提供了重要依据。

关键技术方法：本研究采用AAPH和H₂O₂化学氧化AdmAb；通过液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）鉴定氧化位点；利用SDS-PAGE、尺寸排阻色谱（SEC）、动态光散射（DLS）和静态光散射（SLS）评估高分子量/低分子量物种及聚集倾向；圆二色（CD）光谱、内源荧光、差示扫描量热（DSC）、纳米差示扫描荧光（nanoDSF）及化学变性评估高级结构和构象稳定性；成像毛细管等电聚焦（icIEF）分析电荷变异体；生物层干涉（BLI）测定FcRn结合；动物实验采用雄性Wistar-Han大鼠（Charles River Laboratories），血浆药物浓度经免疫沉淀和SDS-PAGE定量，SC滞留通过IRDye 800CW标记和活体荧光成像监测。

研究结果如下：

（1）氧化AdmAb的HPLC-MS/MS分析：通过HPLC-MS/MS检测到Met256（CH₂域）和Met432（CH₃域）为主要氧化位点，H₂O₂氧化水平高于AAPH；AAPH还氧化Trp53，生成羟色氨酸（+16）和N-甲酰犬尿氨酸（+32）。

（2）氧化AdmAb变体中高/低分子量物种的评价：SDS-PAGE显示AAPH氧化产生约5%二硫键连接二聚体及约3%片段；SEC显示约4%可溶聚集体；DLS和SLS结果证实存在低聚物。H₂O₂氧化未观察到类似二聚体。

（3）氧化对高级结构和构象稳定性的影响：CD光谱显示氧化导致β-折叠减少、无序结构增加，H₂O₂氧化效应更显著；DSC和nanoDSF显示CH₂域熔解温度（T_m）降低，H₂O₂降低更明显；GdnHCl化学变性进一步证实CH₂域稳定性下降。

（4）氧化对聚集倾向的影响：DLS/SLS热升温实验显示，氧化变体的解折叠和聚集起始温度均较未氧化对照提前；pH跳变实验显示，所有样品在pH 7.4下浊度增加，但氧化状态并未额外增加沉淀倾向。

（5）氧化对电荷变异体的影响：icIEF显示AAPH氧化使主峰面积减少14–20%，酸性变异体增加10–15%，碱性变异体增加；H₂O₂氧化亦增加碱性变异体。

（6）氧化对FcRn结合的影响：BLI显示两种氧化均降低AdmAb与大鼠和人FcRn的结合亲和力，H₂O₂氧化降低更显著。动力学分析表明，对人FcRn的结合降低主要由结合速率常数（k_on）下降导致，对大鼠FcRn则主要由解离速率常数（k_off）增加导致。

（7）监测血液中氧化AdmAb浓度：给予大鼠含18%（w/w）氧化物种的混合物（SC或IV）后，血浆浓度-时间曲线显示氧化变体的药时曲线下面积（AUC）较对照略有下降，但无统计学显著性；IV给药组AUC亦无显著差异。

（8）监测荧光标记AdmAb在SC注射部位的滞留：活体荧光成像显示氧化变体在SC组织的荧光信号在96 h和168 h显著高于对照，荧光-时间曲线下面积增大，表明滞留时间延长但非永久；主要分布于注射部位，少量在肾。

讨论部分指出，AAPH通过产生过氧自由基氧化Met和Trp，H₂O₂则通过亲核攻击氧化Met。Met256和Met432的表面暴露使其易受氧化。AAPH氧化Trp53可能破坏邻近二硫键，促进可还原二聚体形成。H₂O₂氧化主要降低CH₂域稳定性，与Met256氧化破坏稳定氢键有关。FcRn结合降低可能源于Met氧化扰乱CH₂-CH₃界面疏水作用，Met432邻近His433干扰pH依赖性结合。在18%氧化比例下，未氧化重链仍可介导FcRn结合，故SC BA仅轻微下降。pH跳变实验排除了氧化显著增加沉淀的可能性，提示SC滞留延长可能由构象稳定性降低导致。未来研究需探讨更高氧化水平、免疫原性、细胞外基质及淋巴系统相互作用。

研究结论（翻译）：AAPH和H₂O₂氧化AdmAb主要靶向Met残基，尤其是Fc区内的Met残基。AAPH还诱导CDR区Trp氧化，可能促进可还原二聚体的形成。H₂O₂氧化显著降低AdmAb的二级和三级结构稳定性，而AAPH影响相对温和。此外，氧化降低构象稳定性、增加聚集倾向并改变电荷变异体谱。两种氧化条件均显著降低与人、大鼠FcRn的结合亲和力，其中H₂O₂氧化影响更明显。尽管存在这些结构和功能变化，给予18%（w/w）氧化物种混合物仅导致SC BA轻微下降，总体PK谱基本维持。荧光成像显示氧化变体在SC组织滞留时间显著延长，与H₂O₂氧化AdmAb观察到的较低峰浓度（C_max）一致。然而，鉴于总体SC BA相似，氧化变体的SC滞留延长似乎并非永久性。氧化物种构象稳定性降低（而非FcRn结合亲和力受损）可能部分解释PK谱的微小变化，包括氧化物种在SC组织中的较长滞留。此外，pH跳变实验显示所有AdmAb样品在生理pH下浊度增加，但增幅与氧化状态无关，提示单独氧化不会显著增加沉淀倾向。未来研究将探讨更高氧化水平、免疫原性、与SC细胞外基质和淋巴系统的相互作用，以及更生物相关的SC微环境模型，以进一步阐明氧化mAbs吸收和滞留的机制。