传统甘草牛奶炮制处理山榄（Alangium chinense (Lour.) Harms）通过调节EGFR/PI3K/AKT信号通路降低肝毒性并增强生物活性

《Journal of Ethnopharmacology》：Traditional Licorice-Milk Processing of Alangium chinense (Lour.) Harms Reduces Hepatotoxicity and Enhances Bioactivity via EGFR/PI3K/AKT Pathway Modulation

　　

摘要

民族药理学相关性

五层龙（Lour.）Harms（简称AC）是一种传统苗族药用植物，广泛用于治疗风湿性和炎症性疾病。尽管AC具有治疗功效，但其肝毒性限制了其临床安全应用。历史上，人们采用甘草和牛奶对其进行传统炮制，以降低毒性并增强疗效，但其化学基础和潜在机制仍未完全阐明。

研究目的

本研究旨在阐明甘草牛奶炮制如何改变AC的化学组成，鉴定关键入血成分，并阐明减毒增效的机制。

材料与方法

通过多指标正交设计，采用优化的甘草牛奶煎煮法对AC进行炮制。通过血清生化检测、组织病理学和二甲苯致耳肿胀实验，在大鼠模型中评估了生品AC（RAC）和炮制品AC（PAC）的毒理学和药理学作用。采用基于UPLC-MS/MS的代谢组学和血清药物化学方法鉴定化学成分和入血成分。利用网络药理学、分子对接和Western印迹技术分析肝毒性相关靶点，并验证信号通路的参与情况。

结果

炮制显著改变了AC的化学谱，总毒性生物碱含量降低了27.1%，而黄酮类和酚类含量分别增加了14.8%和50.2%。PAC显著降低了大鼠血清中AST、ALT和ALP的水平，减轻了肝组织损伤，并抑制了二甲苯引起的耳部肿胀。代谢组学分析鉴定出56种差异化合物，其中16种为PAC特有。血清药物化学揭示了175种入血成分，其中27种与肝毒性差异相关，包括18β-甘草次酸、恩诺酮和烟碱。网络药理学突出显示EGFR/PI3K/AKT级联反应为核心网络。分子对接和100纳秒分子动力学模拟表明，代表性化合物在下游激酶AKT1的活性位点内形成了热力学稳定的复合物（骨架RMSD ≈ 0.238–0.246 nm）。组织水平Western印迹分析显示，PAC调节了RAC诱导的EGFR、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT异常表达，提示该轴可能在减轻肝毒性中发挥作用。

结论

甘草牛奶炮制AC通过调节毒性生物碱和保护性代谢物，在减轻肝毒性的同时保留了抗炎疗效。肝毒性减弱与EGFR/PI3K/AKT信号通路的系统性调节密切相关。这些发现为传统炮制提供了动态生物物理学见解，并支持AC的临床安全应用。

引言

作为中华民族的瑰宝，中医药体现了数千年来积累的医学智慧和哲学洞见。其独特的理论框架、丰富的药材资源和确凿的治疗功效，使其在医疗保健领域确立了重要地位。然而，中医药天生具有疗效与毒性双重属性（Xu等，2025）。在此背景下，“毒性”并非指现代药理学中定义的致命毒药，而是指物质固有的偏性或强度，用于恢复生理平衡。疗效与毒性之间的复杂相互作用，使得中医药的应用既独特又充满挑战。因此，在保证疗效的同时最大限度地减少潜在危害，已成为当代研究的关键焦点。目前，降低有毒中药毒性的主要方法包括配伍和炮制。其中，炮制在古代亦称“炮炙”和“修治”，是中医药长期临床用药经验的总结。炮制后的药材作为药物使用，体现了中医药实践的一个显著特征。通过煎煮、炒、煅、蒸等技术和加入辅助炮制材料，可以改变药材性质，降低毒性，增强疗效，并调整药理学作用（Liang等，2026）。炮制减毒的原理复杂，包括毒性成分的去除、降解和转化。

五层龙（Lour.）Harms，一种五层龙科的须根，在贵州省苗族医学中广泛应用，最早记载于经典本草《本草纲目拾遗》（公元1765年），在中医药中具有超过250年的临床应用历史，用于治疗严重风湿和创伤损伤。五层龙以祛风除湿、舒筋活络、活血通络而闻名，常用于治疗类风湿性关节炎和挫伤等疾病。然而，其显著毒性限制了其临床应用。《本草纲目拾遗》记载，AC“性热力强，有毒，口中有麻木感”。过量或不当使用AC可能导致中毒，出现头晕、乏力、肢体麻木和呼吸困难等症状。严重情况下，可能因呼吸抑制而危及生命。我们研究小组先前的研究表明，AC的水提取物毒性高于醇提取物，肝脏是主要靶器官。肝毒性似乎是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路的异常激活介导的，导致大鼠肝脏炎症和后续肝组织损伤（Wang等，2025）。目前研究表明，AC的主要毒性成分烟碱具有神经毒性。已证实烟碱能抑制神经和胶质细胞的增殖，以及神经元轴突的生长。快速静脉注射AC可能影响心血管系统，潜在导致心律失常和呼吸刺激。此外，AC的毒性被发现与其烟碱含量呈正相关（Lian等，2022）。为扩大其临床安全应用并减轻严重固有毒性，我们对AC应用了一种特色民族炮制方法（“甘草牛奶煎煮”）。具体而言，《中国民族医药炮制集成》记载，AC传统上使用“甘草牛奶煎煮”进行炮制以达到减毒目的；然而，其具体减毒功效和分子机制尚未得到科学验证。

在民族医药实践中，也积累了丰富的特色炮制经验。在各种炮制辅料中，牛奶作为一种传统安全介质，广泛用于民族医药有毒药材的炮制，尤其在蒙古族和维吾尔族医药中。例如，马钱子（Strychnos nux-vomica L.）和余甘子（Phyllanthus emblica L.）经牛奶炮制后已被证明具有显著的减毒效果。减毒机制可能与牛奶中的蛋白质和磷脂可通过疏水相互作用、氢键和包合物与小分子化合物相互作用有关（Liu等，2015；Wu等，2020）。此外，牛奶中的酪蛋白和乳清蛋白可能在热处理过程中发生美拉德反应，生成具有抗氧化特性的产物，有助于减轻药物的氧化毒性（Yang等，2017）。牛奶炮制不仅降低了士的宁等毒性成分的含量，还增强了药物的镇痛效果，展现出其在减毒增效方面的独特价值（Bao等，2021）。甘草具有调和诸药的功能，在中医药配伍中发挥减毒增效的作用（Tan等，2018）。当甘草与附子配伍时，可诱导CYP450同工酶活性并增加其含量，从而加速乌头碱的代谢，达到配伍减毒的效果（Ju等，2018）。其中，甘草酸可通过诱导CYP3A活性加速雷公藤甲素在体内的代谢和排泄（Tai等，2014）；甘草联合使用还可增强雷公藤等药材对类风湿性关节炎的治疗效果，达到增效的目的（Zhang等，2024）。

在本研究中，如何使用“甘草牛奶煎煮”方法系统改变AC的整体化学基础？哪些关键成分能够入血并发挥作用？减毒增效的潜在分子机制是什么？这些问题尚未得到系统解答。

随着先进分析技术和多学科方法的整合，中医药炮制研究正日益从工艺描述转向机制分析。液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）已被证明是鉴定药物原始成分及其代谢物的高效工具（Xu等，2025）。结合血清药物化学方法，LC-MS有助于揭示这些成分在炮制过程中的动态变化及其与体内过程的相互作用。网络药理学在系统水平上预测药物作用靶点和通路，为解释炮制影响药物疗效和毒性的机制提供了新视角。

在本研究中，我们采用结合代谢组学、血清药物化学、网络药理学、分子对接和实验验证的综合策略，研究甘草牛奶炮制AC的减毒增效机制。系统表征了炮制相关的化学转化、吸收成分、药理活性和分子机制。本研究为传统民族医药炮制实践提供了现代科学证据，并有助于AC的合理安全临床应用。

章节片段

仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific Inc.）；YQ-1000A超声波清洗机（上海一劲超声仪器有限公司）；UV-5100紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；BS-240VET兽医生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子有限公司）；S1010E便携式离心机（SCLOGEX，美国）；SpectraMAX Plus 384酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；PW-960自动洗板机

炮制方法确定

结果显示，与生品AC相比，所有四种炮制品（WAC、MAC、LAC、PAC）均有效降低了烟碱含量（图2A）。值得注意的是，PAC表现出最显著的减毒效果，烟碱含量降低了46.99%。因此，选择PAC进行进一步研究。

牛奶用量调查结果

研究发现，30%牛奶利用率的综合评分最高（图2B）。因此，选取了10%、30%和50%的牛奶利用率进行

讨论

本研究系统阐明了采用传统民族方法“甘草牛奶煎煮”炮制的五层龙（Lour.）Harms（AC）减毒增效作用的科学依据。通过结合正交优化、血清药物化学、网络药理学、分子动力学模拟和实验验证的综合策略，我们证明这种特定的炮制方法会引起深远的化学变化

结论

通过正交实验设计，系统确定了AC“甘草牛奶煎煮”的最优炮制参数。整合血清代谢组学和网络药理学分析，探索了PAC减毒作用的动态机制。研究结果表明，PAC通过调节EGFR/PI3K/AKT信号通路的异常激活并纳入保护性生物活性物质来减轻肝毒性

CRediT作者贡献声明

Dan Nie：可视化、验证。Tingting Feng：资金获取。Xiongwei Liu：项目管理。Yizhen Liu：调查研究。Jingyi Sun：软件、形式分析。Ying Zhou：监督、资金获取。Hongxi Xu：写作 – 审校与编辑。Chang Liu：写作 – 审校与编辑、项目管理、资金获取。Xinyue Wang：写作 – 初稿、调查研究

未引用参考文献

Chen等，2012；Wang等，2023；Wang等，2025；Xu等，2025；Yang等，2017。

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。

本研究经贵州中医药大学实验动物伦理委员会批准。（批准号：2024046、2024045）

利益冲突声明

我们声明本文系原创，未曾发表，也未在别处接受出版考虑，且没有需要披露的利益冲突。

资助

本工作得到国家自然科学基金（编号：82460847）；贵州现代中医药创制重点实验室（黔科合平台[2025]019）；贵州省高层次创新人才（黔科合平台人才-GCC[2023]047）；贵州省特色和综合高效利用特色食药材料创新人才团队建设（平台人才-CXTD[2023]020）的资助。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文报告的工作。

Xinyue Wang | Dan Nie | Tingting Feng | Xiongwei Liu | Yizhen Liu | Jingyi Sun | Ying Zhou | Hongxi Xu | Chang Liu