ST段抬高型心肌梗死中罪犯冠状动脉血栓转录组与全基因组关联的平行分析：一项探索性初步研究

《Journal of the Formosan Medical Association》：Parallel culprit-thrombus transcriptomic and genome-wide association analyses in ST-segment elevation myocardial infarction: An exploratory pilot study

背景：对罪犯冠状动脉血栓进行直接分子表征，可能为了解循环血液未捕获的ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction, STEMI）局部机制提供线索。研究人员调查了血栓相关转录组模式及其与遗传易感性的关系。方法：对10例首次STEMI患者的配对抽吸罪犯血栓和外周血进行高深度RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）。使用DESeq2评估差异表达，探索性信号定义为名义P<0.05且绝对log₂倍数变化（log₂ fold change, log₂FC）≥1.5。Benjamini–Hochberg校正应用于44,525个转录本。还进行了转录本-临床关联和敏感性分析。同时，全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）纳入1787例STEMI患者和17,837例年龄、性别匹配对照。结果：尽管708个转录本满足名义探索性标准，但在全转录组校正后无一保持显著。名义信号汇聚于生物学相关过程，包括细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑、炎症和趋化因子信号、脂质和载脂蛋白调节、血管生成和金属蛋白酶活性。这些模式可能反映局部血栓生物学以及血栓与外周血之间细胞组成的差异。临床相关性和根据既往冠状动脉疾病（coronary artery disease, CAD）的差异在多重校正或敏感性分析后不稳健。全基因组关联分析在MASTL位点鉴定出rs74755602（比值比（odds ratio, OR），2.08；95%置信区间（confidence interval, CI），1.65–2.63；P=7.85×10^?10），但MASTL未显示相应差异表达。结论：配对血栓-血液谱分析揭示了与血栓形成、炎症和血管重塑相关的连贯但探索性转录组模式。独立的MASTL关联缺乏转录组一致性，支持谨慎解释和进一步功能验证。

论文解读：ST段抬高型心肌梗死中罪犯血栓转录组与全基因组关联的平行探索性分析

研究背景与问题：斑块形成和破裂是ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction, STEMI）病理生理的中心驱动因素。稳定动脉粥样硬化向急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）转化，通常由易损斑块破裂触发，进而形成闭塞性冠状动脉血栓，引起缺血级联和心肌损伤。尽管STEMI再灌注治疗已取得进展，患者结局仍存在差异，提示影响梗死大小及周围组织恢复的分子和细胞机制尚不充分。罪犯冠状动脉血栓是斑块破裂部位形成的高度动态复杂微环境，涉及循环血液成分、活化内皮细胞和暴露细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的汇聚与相互作用。既往研究提示STEMI是血栓和炎症状态；尸检可见薄纤维帽粥样斑块，破裂斑块纤维帽裂隙，破裂区富含巨噬细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞；纤维蛋白是冠状动脉血栓主要成分，提示凝血级联激活；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）可促进纤维帽降解并增加斑块破裂风险。RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）进展使心血管疾病分子图景研究更细致。全血RNA-seq在AMI中识别出白细胞激活、血小板功能和代谢相关基因差异表达；缺血性卒中血栓基因表达谱显示心源性栓塞血栓炎症水平高，而大动脉粥样硬化血栓氧化还原和T细胞过程更明显；空间转录图谱已用于探索人动脉粥样硬化斑块破裂位点通路。然而，评估罪犯冠状动脉血栓转录组学在STEMI中的研究仍有限，与全基因组遗传易感性并行分析更少。抽吸血栓与外周血之间转录组差异受细胞组成、组织结构、血小板活化、血管壁物质和STEMI时全身炎症影响，因此需谨慎解释。基于此，研究人员开展探索性初步研究，对首次STEMI患者的配对罪犯部位冠状动脉血栓和外周血进行RNA-seq，并与STEMI全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）平行分析。研究目的是表征区室相关血栓转录特征，评估其与心肌损伤生化标志物的描述性关系，并检查选定的血栓富集候选基因是否位于提示性GWAS位点附近。研究人员将这些分析视为假设生成，而非共享因果机制的确证证据。

关键技术方法概述：纳入10例首次STEMI患者并采集配对罪犯血栓和外周血；GWAS纳入1787例STEMI患者（中国医药大学医院心内科）和17,837例年龄、性别匹配对照（中国医药大学医院遗传数据库/HiGenome）。RNA-seq包括质控、Sentieon-加速STAR比对GRCh38/GENCODE v46、DESeq2差异表达与Benjamini–Hochberg校正、g:Profiler基因本体和京都基因与基因组百科全书富集、Spearman相关和敏感性分析。GWAS使用Affymetrix Axiom TPMv1芯片714,457个单核苷酸多态性，PLINK质控，KING去除重复和一级亲属，SHAPEIT4定相，Beagle v5.2插补，PLINK v2.0 logistic回归调整年龄、性别和主成分。转录组与GWAS平行描述比较，未进行正式表达数量性状位点、共定位、全转录组关联研究或孟德尔随机化。

研究结果：
3.1 患者特征与病程：10例均获得配对罪犯血栓和外周血标本，最终RNA-seq分析纳入10对。队列为8例男性和2例女性，平均年龄56.8±12.6岁。多数为当前或既往吸烟者且超重，平均体重指数27.9±3.6 kg/m²。合并症包括高脂血症7例、高血压4例、糖尿病3例、CAD 3例。平均症状至入院时间294.4±275.4 min，平均入院至球囊时间69.6±28.5 min，平均手术时间38.9±24.2 min，平均住院时间7.7±2.8天。入院时平均白细胞计数12.5±3.3×10³/μL，C反应蛋白5.8±7.6 mg/dL。基线心肌损伤标志物升高，肌酸激酶3504.9±4690.7 U/L，肌酸激酶-MB 332.9±422.0 ng/mL，肌钙蛋白I 3.0±6.1 ng/mL；住院峰值肌酸激酶4404.2±4718.5 U/L，肌酸激酶-MB 420.9±395.5 ng/mL，肌钙蛋白I 107.3±70.7 ng/mL。罪犯血管为左前降支4例、左回旋支2例、右冠状动脉4例。此部分为描述性队列特征。

3.2 血栓中富集表达的基因：研究人员用配对DESeq2模型比较10对血栓与外周血样本。以名义P<0.05为阈值，鉴定出708个名义差异表达转录本，log₂倍数变化范围为?1.50至5.00。对44,525个可分析转录本进行Benjamini–Hochberg校正后，无转录本达到错误发现率q<0.05，最小q=0.956，因此这些转录组发现被解释为探索性。基因本体富集分析显示一组过代表生物过程，前五位为血管发育、血管发育、循环系统发育、解剖结构形态发生和细胞迁移调节；ECM和细胞外空间在细胞组分中排名最高。由于基因在GO条目间重叠，研究人员合并基因集并按STEMI病理生理知识重新分类，识别出四个功能通路：ECM重塑与结构完整性（COL3A1、COL1A2、COL1A1、COL4A2、FN1、SPP1、SERPINE1）、炎症与趋化因子信号（CCL7、CCL18、CCL2、CXCL12）、脂质代谢与载脂蛋白调节（APOE、APOC1）、血管生成和血管功能（KDR、RAMP2、DPYSL3、MET）。结论是名义信号汇聚于生物学相关过程，但仍可能反映局部血栓生物学及血栓与外周血细胞组成差异。

3.3 基因表达与临床和实验室参数的相关性：研究人员对归一化候选转录本丰度与临床或实验室变量进行探索性Spearman相关分析，包括心肌酶释放。多重校正前，若干炎症、金属蛋白酶、脂质相关和内皮激活转录本与初始或峰值肌酸激酶、肌酸激酶-MB呈名义相关。但对308个转录本-变量检验进行Benjamini–Hochberg校正后，无关联保持显著，最小错误发现率q=0.632，敏感性分析也提示这些关联不稳健。这些转录本-酶相关性主要受Patient 8影响，该患者初始和峰值肌酸激酶显著升高，并因不良临床病程需要机械循环支持；排除该患者后，相关减弱且不再显著。既往CAD亚组描述性分析中，7个突出转录本的精确Mann–Whitney U检验P值范围为0.0167至0.3833；MMP19、CCL7、SPP1显示完全秩分离，U=21，精确P=0.0167，但在29个候选转录本面板进行Benjamini–Hochberg校正后均不显著，最小错误发现率q=0.161。因此这些结果被视为探索性、离群值敏感的描述性观察，而非稳健关联。

3.4 STEMI全基因组关联分析：GWAS纳入19,624人，包括1787例STEMI患者和17,837例匹配对照。病例与对照年龄和性别略有差异，平均年龄59.40岁对57.31岁，女性比例14.3%对11.0%；室性心动过速/心室颤动在STEMI中占6.7%，对照中为0；心房颤动在STEMI中占95.7%，对照中为13.6%。最强关联位于染色体10的MASTL位点，超过常规全基因组显著性阈值，lead变异为rs74755602，OR=2.08，95% CI=1.65–2.63，P=7.85×10^?10，错误发现率q=5.57×10^?4。其他位点仅提示关联，未达全基因组显著。研究人员进一步构建聚焦于血栓转录组候选基因的事后Manhattan图，MMP2、MMP7、MMP12、COL4A2、COL3A1、SELE附近位点显示提示性关联，但均未达到P<5×10^?8；其中MMP2和COL4A2关联最突出。若干变异OR<1，但未建立保护或因果效应。由于未进行正式表达数量性状位点、共定位或孟德尔随机化分析，血栓表达与附近遗传变异的关系仍属推测。APOE的rs7412和CCL18的rs79020437也显示OR<1。MASTL在血栓RNA-seq数据中未差异表达，log₂倍数变化?0.05，名义P=0.813，错误发现率q=0.999，且不属于ECM或炎症候选基因特征。结论是MASTL达全基因组显著，但缺乏转录组一致性；候选位点信号仅为探索性和假设生成。

讨论总结与研究结论翻译：
研究人员用高深度RNA-seq配对抽吸罪犯冠状动脉血栓和外周血10例急性STEMI，表征与急性冠状动脉血栓形成相关的探索性转录组模式。血栓富集转录本映射到ECM重塑、炎症、趋化因子信号、脂质处理、血管生成和血管修复。但由于无转录本在全转录组Benjamini–Hochberg错误发现率校正后显著，这些发现应解释为名义、假设生成模式，可能反映局部血栓生物学以及血栓与外周血之间组织和细胞组成差异。名义富集包括结构ECM成分、SPP1即编码Osteopontin、SERPINE1、多种炎症趋化因子、黏附分子SELE、脂质载脂蛋白APOE和APOC1、血管生成相关KDR、RAMP2、MET、DPYSL3。整体上符合炎症、基质重塑和伤口愈合环境，但不建立血栓特异性转录调控。若干转录本与肌酸激酶或肌酸激酶-MB名义相关，但308个检验校正后无显著；MMP7、MMP12、SERPINE1相关在排除Patient 8后减弱，leave-one-out分析识别该临床严重参与者为最有影响或共同最有影响的观察。无心脏磁共振梗死大小和标准化左心室射血分数数据，限制对结构性心肌损伤的直接评估。MMP转录本需情境依赖解释：MMP7和MMP12名义相关不耐受多重校正且对排除影响病例敏感；MMP2不应视为简单表达-基因型悖论，bulk RNA-seq测量破裂后异质血栓中的mRNA丰度，而非破裂前纤维帽中的MMP2酶活性，单细胞分析显示冠状动脉血栓内存在显著细胞异质性；MMP2转录丰度不直接指示净蛋白水解活性，后者还依赖细胞外激活和内源抑制；升高的血栓MMP2可能反映基质周转、掺入血管细胞、炎症细胞组成或破裂后修复反应，不能统一归为有害或保护。COL4A2也需区室和时间特异解释；抽吸血栓中COL4A2丰度是斑块破裂后急性测量，可能反映掺入血管壁物质、细胞组成或基质修复。血栓COL4A2转录本丰富不意味着终身遗传性增加COL4A2表达促进STEMI；与较低STEMI风险相关变异不能在没有直接调控证据时假定降低或增加COL4A2表达。若干超罕见MMP2和COL4A2变异显示更高STEMI风险方向，与部分常见变异相反；这种模式可能提示等位异质性，但极低等位频率、稀疏携带者、插补不确定性、连锁不平衡和机会同样可能。因这些变异未达全基因组显著且未经测序或功能确证，未指定变异特异生物学方向。更广泛而言，转录组和基因组分析应视为平行而非汇聚：急性血栓RNA丰度捕获斑块破裂后组成依赖局部状态，受募集血细胞、血管壁物质、炎症、基质周转和伤口愈合影响；种系关联信号反映终身遗传易感性，可能作用于血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨核细胞、血小板或其他组织。位于或靠近MMP2、COL4A2或MASTL的变异不能仅凭基因组位置归因于该基因或解释为增减其表达或功能。限制包括RNA-seq队列小且无转录本经全转录组错误发现率校正后显著；小样本限制个体异质性建模和临床协变量调整；患者需成功罪犯血栓抽吸和配对血采集，可能不代表所有STEMI；无预入组筛查日志，无法重建潜在合格但未入组患者数量和特征；外周血不是冠状动脉血栓组织的中性比较；转录本-临床相关和既往CAD亚组比较功效不足、受严重病例影响且多重校正后不显著；无心脏磁共振梗死大小和标准化左心室射血分数数据，肌酸激酶、肌酸激酶-MB和肌钙蛋白仅作心肌损伤生化标志物；RNA-seq和GWAS平行分析无正式表达数量性状位点、共定位、全转录组关联研究或孟德尔随机化，不能因果推断；MASTL关联需独立队列重复，超罕见变异估计易受稀疏携带和插补不确定性影响；残余血栓材料不足以进行RT-qPCR、western blot、ELISA、免疫组织化学或免疫荧光验证；所有20份标本RNA完整性值范围为6.7至9.9，但无预入组筛查日志限制完整回顾报告。未来需更大配对血栓、血液、基因型、影像和蛋白验证数据集，以确定这些探索性发现是否可重复且具有生物学意义。

研究结论翻译：总而言之，这项探索性初步研究平行分析罪犯血栓转录组学和STEMI遗传学，而非通过正式因果整合。转录组分析识别出名义、组成敏感模式，涉及ECM重塑、炎症和趋化因子信号、脂质-载脂蛋白调节和血管修复；GWAS识别出MASTL位点全基因组显著信号，以及MMP2和COL4A2附近仅提示性的事后候选位点信号。由于无转录本在全转录组校正后显著，转录组-临床关联对多重校正和敏感性分析不稳健，MASTL缺乏相应差异转录组表达，且未进行蛋白水平验证或正式遗传整合，这些发现应被视为彼此不同的、假设生成性观察，而非汇聚机制或已验证治疗靶点的证据。