pH梯度抗原亲和层析中的静电反转：对去酰胺化曲妥珠蛋白型变体的选择性偏差

《Journal of Chromatography A》：Electrostatic Inversion in pH-Gradient Antigen Affinity Chromatography: The Selectivity Bias for Deamidated Trastuzumab Proteoforms

# 摘要/亮点- 中等分子量阳离子交换色谱富集技术可分离特定的曲妥珠单抗Fab蛋白型。- 梯度pH的HER2亲和色谱使脱酰胺变异体的保留产生偏差。- 酸性洗脱条件有利于HER2与LC-N30D曲妥珠单抗的结合。- 正交表面等离子共振（SPR）实验证明，亲和色谱的保留时间可能无法反映天然靶点亲和力。- 分子动力学（MD）模拟证实了在低pH条件下质子化依赖的界面稳定化机制。---# 引言治疗性单克隆抗体（mAbs）的全面表征需要高分辨率分析方法，以将特定的化学修饰和翻译后修饰（PTMs）与功能影响联系起来 [1]。在制造和储存过程中，mAbs会发生各种翻译后修饰，如糖基化、脱酰胺化、异构化和氧化，从而形成复杂的蛋白型混合物，这些蛋白型可能具有不同的疗效或安全性特征 [2]。虽然传统的结合实验，如表面等离子共振（SPR）或酶联免疫吸附测定，能够提供定量的亲和力数据，但它们缺乏分子分辨率来区分混合物中各个蛋白型的功能贡献 [3]。因此，将特定的翻译后修饰定义为因功能影响而导致的关键质量属性（CQA），通常需要费力的通过离子交换色谱进行馏分收集，然后再进行离线功能测试 [4,5]。为了简化传统方法，亲和色谱（AC）在线联用质谱（AC-MS）作为一种强大的技术应运而生，可同时实现功能分离和结构质谱分析 [6,7]。通过利用治疗靶点作为固定相，AC-MS提供了一种定性的功能-结构方法，根据保留时间——一种反映结合强度的指标——来区分变异体，同时提供洗脱蛋白型的质谱鉴定。AC(-MS)最常采用pH梯度来洗脱蛋白质 [[8], [9], [10], [11]]。曲妥珠单抗是一种靶向人表皮生长因子受体2（HER2）的人源化IgG1抗体，由于其降解途径已被充分表征 [10,[12], [13], [14], [15]]，它成为评估研究结构-功能关系工具的模型分子。多项研究在互补决定区（CDRs）中发现了两个主要的降解热点：重链天冬氨酸102的异构化（HC-D102）和轻链天冬酰胺30的脱酰胺化（LC-N30）[5,13,14]。虽然LC-N30脱酰胺化（LC-N30D）和HC-D102异构化（HC-D102iso）被认为是易感翻译后修饰，但它们在HER2结合方面的功能影响在不同研究中存在差异 [5,10,[13], [14], [15]]。特别是，LC-N30脱酰胺化在梯度pH的HER2 AC中的行为与正交结合评估研究的结果相矛盾 [10]。AC(-MS)所需的特定实验条件可能引发非生理性的静电相互作用 [[16], [17], [18]]。这要求对保留行为进行谨慎的解读，因为这些因素可能与标准结合或功能实验以及生物学相关条件的情况存在很大偏差。因此，本研究旨在调查HER2 AC中所述的生物分析差异，并阐明pH梯度分离的基本机制。我们假设HER2 AC中使用的特定洗脱条件可能会影响蛋白型结合排名的功能性转化。为研究这一问题，我们采用了一种中等分子量分析方法，通过阳离子交换色谱（CEX）对Fab电荷变异体进行馏分分离，从而生成高度富集的LC-N30脱酰胺化、HC-D102异构化及其组合的蛋白型。随后，这些富集的CEX Fab馏分通过HER2 AC-MS和SPR进行分析。此外，还使用分子动力学（MD）和炼金术自由能预测作为计算工具，以从机制上揭示AC洗脱条件下的结合与生理结合条件下结合之间的差异。---# 各章节摘要## 抗体曲妥珠单抗由公司内部生产，用于研发目的。在制剂缓冲液（pH 6.0）中施加热应激条件，在45°C下处理30天，以提高LC-N30脱酰胺化和HC-D102异构化的水平。Fab片段通过按照制造商说明书使用FabDELLO（Genovis）消化曲妥珠单抗获得。简而言之，消化在50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、10 mM CaCl2、pH 7.6的条件下进行，温度为37°C，时长2小时，酶量为1单位FabDELLO/μg曲妥珠单抗。## 曲妥珠单抗Fab蛋白型的制备与纯度分析LC-N30脱酰胺化和HC-D102异构化是曲妥珠单抗已知影响HER2结合的主要翻译后修饰，且在热应激条件下水平升高 [14,15]。对完整曲妥珠单抗进行的HER2亲和色谱分析表明，HER2 AC-MS无法充分分离应激样品中的蛋白型，这归因于二价性和亲合效应（**图S3**）。虽然在铰链区上方切割产生了单个Fab片段并在HER2 AC-MS中提供了更好的分离效果，## 结论采用AC(-MS)旨在为产品开发过程中的生物制品功能与结构表征提供一种额外的快速分析工具。我们的案例研究表明，蛋白型在HER2 AC中的保留时间顺序与使用SPR在生理条件下检测到的LC-N30脱酰胺化蛋白型的亲和力行为并不直接相关。LC-N30D曲妥珠单抗变异体中观察到的pH影响表明，AC洗脱条件可能会## CRediT作者贡献声明**Steffen Lippold：** 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，可视化，监督，方法学，调查研究，形式分析，数据整理，概念设计。**Skanda Sastry：** 撰写 – 初稿，可视化，方法学，形式分析，数据整理，概念设计。**Kevin Whang：** 撰写 – 初稿，可视化，方法学，调查研究，形式分析，数据整理。**Kelvin Chang：** 撰写 – 初稿，方法学，调查研究，形式分析，---## 利益冲突声明作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些关系可能影响本文所述工作的客观性。---## 致谢作者感谢Alexander Knaupp在柱填充方面提供的技术协助，以及Christian Spick在SPR数据分析方面给予的宝贵支持。我们也衷心感谢Liz Johnson、Jeff Zhang、Terence Ng和Patrick Bulau对稿件进行的批判性审阅和富有洞察力的反馈。---Steffen Lippold | Skanda Sastry | Kevin Whang | Kelvin Chang | Michael Kim | Feng Yang | Tilman Schlothauer