高效液相色谱指纹图谱的相似性与差异性度量在草药提取物质量控制中的应用——以橄榄叶、榛叶和岩蔷薇叶掺假鼠尾草为例

《Journal of Chromatography A》：Similarity and dissimilarity measures for HPLC fingerprints in quality control of herbal extracts – Case study of sage adulteration by olive, hazelnut, and cistus leaves

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  在 115 个 HPLC 草药指纹图谱上评估了七种相似度和距离度量。
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  在基于共识的比较中，皮尔逊系数和一致系数表现最佳。
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  峰对齐和信号归一化增加了误分类率。
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  切比雪夫距离对明显的峰形位移提供了高灵敏度。
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  基于原始信号的排名指标在重叠指纹图谱中表现最好。

引言

草药复杂且多变的化学成分，取决于物种、种植、气候和收获时间 [[1], [2], [3], [4]]，会影响最终产品的整体质量。此外，草药香料和药品的高经济价值使得掺假成为全球市场中的常见问题 [5]。例如，牛至或鼠尾草等香料经常掺假成廉价的草药材料，包括橄榄、榛子或岩蔷薇叶 [6,7]。同样，藏红花和八角等其他优质材料也常被低等级或有毒替代品取代 [8]。因此，迫切需要开发稳健的分析方法用于草药产品的质量控制 [9]。

草药产品，尤其是草药药品和香料的宏观和微观性质，通常是其质量控制的起点，并附加化学生物标志物，被欧洲药典 [10]、美国药典 [11] 和中华人民共和国药典 [12] 等法规认定为必不可少的工具。然而，由于草药基质复杂、多组分的性质，仅依靠宏观和微观特征及少数孤立的化学标志物往往是不够的。因此，建立整个草药提取物的特征指纹图谱轮廓，无论是光谱还是色谱，都提供了更可靠的质量控制手段 [13]。欧洲药品管理局 (EMA) [14]、美国食品药品监督管理局 (FDA) [15] 和世界卫生组织 (WHO) [16] 等监管机构，以及中华人民共和国药典 [12]，接受草药指纹图谱作为其鉴定的工具，与草药的微观和宏观性质并行使用。

既然草药提取物的色谱指纹图谱包含众多强度各异的峰，它们的分析和比较需要不同的化学计量学方法 [17]。它们要么基于 i) 多变量技术，如主成分分析 (PCA)、偏最小二乘回归 (PLS) 或偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 等 [6,7,[17], [18], [19]]，要么基于 ii) 相似性分析 [20]。

第一组依赖分类和回归技术来构建用于质量评估的模型。然而，由于实验室内部和实验室间变异导致的色谱指纹图谱变化，加上算法的复杂性，可能会限制此类方法的可转移性。另一方面，相似性分析的方法更直接。即，使用各种相似度度量将未知样本的指纹图谱与参考指纹图谱进行比较。在相似度度量中，最常使用的是皮尔逊相关系数和一致系数 [13,21]。相比之下，距离度量不常用于直接的指纹图谱比较；相反，它们是作为探索性数据分析的一部分计算得出的 [8]。相似性分析有两个主要问题：i) 选择合适的参考指纹图谱和 ii) 选择适当的相似度或距离度量，同时进行不同的色谱数据预处理。参考指纹图谱可以从标准草药或标准草药产品中获得。然而，如果标准品不可用，该草药多个样本色谱数据的平均值或中位数可以作为参考 [20]。关于选择合适的相似度度量，迄今为止已进行了几项广泛的研究 [5,8,20,22]。但是，选择合适的相似度或距离度量来比较色谱指纹图谱仍然存在困难，特别是关于不同的信号预处理方法（如色谱峰对齐或归一化）对这些度量及其分类性能的具体影响。因此，本研究的目的是在相似性分析的背景下，调查参数化（皮尔逊相关系数、一致系数）和非参数化相似度度量（斯皮尔曼和肯德尔相关系数）以及几种闵可夫斯基距离（欧几里得、曼哈顿和切比雪夫）在草药提取物质量控制中的行为。特别强调了色谱信号预处理（例如相关优化扭曲和标准正态变量），以及特定的掺假类型和水平，使用用橄榄、榛子和岩蔷薇叶掺假鼠尾草作为模型系统。评估度量考虑了两种主要方法：i) 与共识进行比较，将行为最接近基于共识的解决方案的度量评估为优越；以及 ii) 它们的分类性能，这考虑了它们从假冒样本中区分真实样本的能力。

章节摘要

理论和计算

如果一系列色谱指纹图谱被排列在一个矩阵中，将样本放在行 i，将保留时间放在列 j，那么每个数据点，x_ij，代表样本 i 在保留时间 j 处的分析信号。两个指纹图谱 A 和 B 之间的相似度可以定义为一个函数 S(A,B)，具有以下属性：a) 非负性 $S\left(A,B\right)\ge 0$；b) 同一性 $S\left(A,A\right)=1$；以及对称性 $S\left(A,B\right)=S\left(B,A\right)$ [23]。

大多数相似度介于 0 和 1 之间，其中 1 表示最大值，0

样本收集、制备和提取程序

收集的鼠尾草 (SG, n?=?30)、榛子 (HZ, n?=?3)、岩蔷薇 (CS, n?=?3) 和橄榄叶 (OL, n?=?3) 样本均为新鲜形态，原产地真实。SG 来自塞尔维亚贝尔格莱德“约西夫·潘契奇”博士药用植物研究所。HZ 和 CS 样本采集自塞尔维亚的温室，而 OL 叶采集自希腊的不同地点。除了 SG（其原产地由药用植物研究所保证）之外，所有样本都经过了植物学

提取物的色谱轮廓、距离和相似度度量

收集的所有样本的 HPLC 轮廓均以众多尖锐峰为特征，特别是在大约 t_R?=?3, 4, 13, 16, 18 和 37 分钟的保留时间处（图 1a）。

SG 样本以 2.77、3.74、12.52、16.41、17.58、21.65、35.12 和 36.49 分钟处的几个显著峰为特征（图 1b），而 OL 叶提取物在 2.91 和 3.86 分钟处有两个小峰，在 13.66 和 18.01 分钟处有两个主峰（图 1c）。CS 提取物仅显示 2.91 分钟和 3.78 分钟处的两个峰，而 HZ 在

结论

基于共识的排名差异之和 (SRD) 表明一致系数 (CNG) 和皮尔逊相关 (PEA) 是最佳度量，始终产生最低的 SRD 分数。鉴于 PEA 和 CNG 在指纹图谱相似性分析中最常被使用，这一发现令人鼓舞。然而，它们的 SRD 排名对信号预处理敏感。另一方面，SPE 的 SRD 排名受预处理变化影响最小。同时，切比雪夫

CRediT 作者贡献声明

Nina Soldat：写作 – 初稿，可视化，方法学，形式分析。Filip Andri?：写作 – 审阅与编辑，监督，方法学，形式分析，数据管理，概念化。

未引用参考文献

[31]

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Nina Soldat：写作 – 初稿，可视化，方法学，形式分析。Filip Andri?：写作 – 审阅与编辑，监督，方法学，形式分析，数据管理，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能被认为影响了本文报告的工作。

致谢

本工作由塞尔维亚共和国科学、技术发展与创新部支持，合同编号：451-03-136/2025-03/200168 和 451-03-136/2025-03/200288。

Nina Soldat|Filip Andri?