短期甲硫氨酸饥饿重塑肝脏m6A RNA甲基化的昼夜节律并调控代谢适应

《Journal of Biological Chemistry》：Short-term methionine starvation reshapes diurnal hepatic m6A RNA methylation

膳食甲硫氨酸限制（dietary methionine restriction, MR）可改善代谢健康，并在多种疾病情境中具有治疗潜力。甲硫氨酸代谢通过调节S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, SAM）的可利用性来调控转甲基反应，包括N⁶-甲基腺苷（N⁶-methyladenosine, m⁶A）RNA甲基化。m⁶A甲基化和甲硫氨酸代谢已分别与昼夜节律调控相关联，但膳食甲硫氨酸是否通过m⁶A影响昼夜节律仍未知。研究人员发现，短期甲硫氨酸剥夺诱导血清甲硫氨酸和SAM的昼夜变化，并重编程小鼠肝脏中m⁶A“写入器”（writers）、“擦除器”（erasers）和“阅读器”（readers）的昼夜表达。在两个时间点（ZT9、ZT21）进行的甲基化RNA免疫沉淀测序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing, MeRIP-seq）显示，相对于对照，甲硫氨酸缺乏（methionine-deficient, MD）饮食与两个时间点之间差异甲基化m⁶A峰约增加10倍相关，尽管核心钟转录本上的甲基化未发生变化。这些饮食诱导的振荡出现在对照饮食下已被甲基化的位点，表明甲硫氨酸限制改变的是既存m⁶A标记的节律性，而不是诱导新的甲基化，并且这些变化富集于参与RNA加工、翻译、泛素化和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）信号传导的转录本。研究人员整合RNA-seq和蛋白质组学，发现这些m⁶A变化中一部分与改变的mRNA和/或蛋白丰度共现，表明为基因特异性而非全局效应。值得注意的是，编码甲硫氨酸稳态核心酶的Mat2a和Cbs的m⁶A甲基化降低，分别与MAT2A蛋白水平升高和CBS蛋白水平降低相关。这些发现确定饮食诱导的、具有昼夜节律的m⁶A甲基化是连接甲硫氨酸代谢与昼夜节律生物学的候选机制，并提示特定m⁶A位点和通路供未来研究。

研究背景：昼夜节律与代谢紧密相连，昼夜节律紊乱可导致多种代谢疾病，而代谢干预可重置昼夜节律。甲硫氨酸代谢影响表观遗传调控、氧化还原平衡、蛋白质翻译和脂质稳态；膳食甲硫氨酸限制（MR）可改善代谢健康、延长寿命、抑制肿瘤生长并增强癌症治疗。m⁶A RNA修饰是真核RNA中最丰富的内部修饰之一，调控RNA剪接、翻译和稳定性，并可通过Per2、Arntl、CK1δ、Nr1d1和Clock等参与昼夜节律调控。SAM由甲硫氨酸腺苷转移酶（MATs）从甲硫氨酸和ATP合成，是DNA、RNA和蛋白质转甲基反应的主要甲基供体，并受SAMTOR、PRMT1和METTL16等监测。甲硫氨酸饥饿时，Mat2a mRNA的m⁶A降低，可增加mRNA稳定性和剪接，诱导MAT2A表达以补偿SAM下降。尽管甲硫氨酸代谢和m⁶A均与昼夜节律相关，但膳食甲硫氨酸是否通过m⁶A调控昼夜节律仍未知。研究人员围绕序贯模型开展研究：先确定MD饮食对甲硫氨酸和SAM昼夜可利用性的影响，再检查m⁶A机器表达，随后用MeRIP-seq探索m⁶A RNA甲基化，并整合RNA-seq和定量蛋白质组学。研究结论为：短期甲硫氨酸剥夺诱导血清甲硫氨酸和SAM昼夜变化，重编程肝脏m⁶A写入器、擦除器和阅读器表达，使对照中已甲基化但非节律性的m⁶A位点转化为节律性位点，且这些变化具有基因特异性，与特定转录本mRNA和/或蛋白丰度或翻译变化相关。这些发现提示饮食诱导的节律性m⁶A是连接甲硫氨酸代谢与昼夜节律生物学的候选机制。

关键技术方法：使用6月龄雄性C57BL/6J小鼠（JAX, 00064，来自Jackson Laboratory），在SPF条件和12小时光/暗周期下饲养，适应2周后给予对照饮食（Envigo TD.01084，0.82%甲硫氨酸）或MD饮食（Envigo TD.140119，0%甲硫氨酸）3周。血清甲硫氨酸和SAM于ZT3、ZT9、ZT15、ZT21用液相色谱-串联质谱检测。肝脏MeRIP-seq在ZT9和ZT21进行，使用TRESS、MetaTX和HOMER分析m⁶A峰、基序和差异甲基化；RNA-seq数据来自同队列GEO GSE240881，用EdgeR鉴定差异表达基因（DEG）；ZT21肝脏进行无标记定量蛋白质组学LC-MS/MS分析；免疫印迹验证MAT2A和CBS蛋白，代谢物检测肝脏胱硫醚。

研究结果：
短期甲硫氨酸剥夺诱导血清甲硫氨酸和SAM水平昼夜变化。通过对照或MD饮食3周及四个时间点血清检测，对照组甲硫氨酸和SAM稳定；MD组总体血清甲硫氨酸显著降低，且甲硫氨酸和SAM呈现昼夜变异。ZT9具有MD组最高SAM，ZT21具有最低SAM，因此被选作后续m⁶A分析对比。
MD饮食重编程m⁶A写入器、擦除器和阅读器昼夜表达。通过同队列RNA-seq分析，Mettl3和Mettl14基本不变；Mettl16在ZT1和ZT5升高，Wtap在ZT1、ZT17和ZT21升高；Alkbh5在ZT21升高，Fto不变；Ythdf1、Ythdf2和Ythdf3在ZT1、ZT17和ZT21升高，Ythdc1在ZT17和ZT21升高，Ythdc2在ZT1升高。结论为MD饮食改变m⁶A机器组分的昼夜表达。
甲硫氨酸饥饿诱导m⁶A昼夜振荡且独立于核心钟转录本甲基化。MeRIP-seq鉴定9,753个m⁶A峰，富集于终止密码子附近和RRACH共有基序。核心钟基因Clock、Arntl、Per1、Per2、Per3、Cry2和Nr1d2存在m⁶A，但两种饮食下ZT9与ZT21间无显著差异。对照仅约100个节律性m⁶A峰，MD约1,000个，增加约10倍；所有新振荡位点在对照中已甲基化，MD未诱导新位点；SAM较低的ZT21多数m⁶A降低。说明甲硫氨酸饥饿并非主要通过直接改变核心钟转录本m⁶A来重塑节律。
饮食诱导m⁶A振荡富集于蛋白稳态和mTORC1信号通路。对MD组ZT21较ZT9降低m⁶A的645个基因进行基因本体分析，富集于蛋白泛素化、翻译、蛋白转运、mRNA剪接加工和mTORC1信号。Rptor、Mfsd8和Mlst8的3′UTR m⁶A降低；泛素相关基因包括Ube2d2a、Ube2g1、Rnf7、Rbx1、Nedd4和Trim27；翻译相关基因包括Mrpl4、Mrps17、Mrpl10、Mrps23、Etf1和Rsl24d1。提示饮食诱导m⁶A振荡与RNA和蛋白稳态相关。
m⁶A变化对mRNA丰度具有基因特异性而非全局效应。聚焦ZT21，MD组相较对照鉴定950个差异m⁶A峰，其中726个降低，包括Mat2a、Cbs和Ddx17，且富集RRACH基序。整合RNA-seq发现3,511个DEG（FDR < 0.01），其中243个（约7%）兼具m⁶A改变，说明m⁶A不是mRNA积累的主要全局驱动。Mat2a、Trim27和Mrps23的m⁶A降低且稳态转录本升高；Trim27在活动期ZT17和ZT21升高，Mrps23和Mat2a在多数昼夜周期升高。提示m⁶A对特定转录本具有选择性转录后调控作用。
m⁶A变化与蛋白丰度的转录后调控相关。ZT21定量蛋白质组学检出635个差异蛋白，其中280个降低、355个升高，总体蛋白丰度与mRNA表达正相关。SCD1的mRNA和蛋白降低，SULT1E1升高；CBS和DDX17蛋白改变但mRNA变化较小。62个蛋白同时具有差异m⁶A和蛋白丰度改变，包括MAT2A、CBS和DDX17。DDX17 m⁶A降低、蛋白升高而mRNA不变，提示其翻译可能受m⁶A调控。
MAT2A和CBS的差异m⁶A相关调控连接甲硫氨酸代谢与m⁶A动态。免疫印迹证实MD组CBS降低、MAT2A升高。Mat2a m⁶A降低与mRNA和蛋白升高一致，符合既往甲硫氨酸饥饿通过降低m⁶A促进Mat2a RNA剪接和稳定性的发现。Cbs m⁶A降低与CBS蛋白降低而mRNA不变，提示m⁶A可能调控CBS翻译；肝脏胱硫醚水平降低。尽管Cbs和Mat2a的m⁶A均降低，但mRNA和蛋白变化不同，作者提出不同m⁶A阅读器可能差异作用于这些转录本。总体上，数据支持模型：甲硫氨酸剥夺改变甲硫氨酸和SAM昼夜可利用性，伴随既存m⁶A标记的节律性重塑，选择性影响特定代谢和蛋白稳态转录本。

讨论部分总结：作者指出昼夜钟与代谢紧密相连，m⁶A RNA甲基化与昼夜节律存在双向关系。MeRIP-seq确认核心钟转录本存在m⁶A，但ZT9与ZT21间无差异，因此不支持甲硫氨酸饥饿主要通过直接改变核心钟转录本m⁶A来重塑肝脏节律。MD组约1,000个m⁶A峰出现差异，比对照高一个数量级，提示非钟基因靶点的m⁶A动态可能参与肝脏节律重塑。甲硫氨酸限制降低SAM，Mat2a m⁶A由METTL16催化以维持SAM稳态；Mat2a m⁶A降低与mRNA和蛋白升高一致。Cbs m⁶A降低与CBS蛋白降低而mRNA不变，提示m⁶A相关翻译调控；作者提出若CBS降低反映转硫作用下降，可能使同型半胱氨酸转向再甲基化生成甲硫氨酸作为代偿，但强调该模型仍需进一步研究。MD中超过70%的日间可变m⁶A峰在ZT21低甲基化，与SAM和甲硫氨酸最低时间一致，提示SAM可用性与m⁶A日间景观相关。SAM通过PRMT1和SAMTOR调节mTORC1；甲硫氨酸缺乏时SAMTOR结合GATOR1抑制mTORC1，SAM充足时破坏SAMTOR-GATOR1复合物促进mTORC1。已有研究报道mTORC1激活促进m⁶A mRNA甲基化，因此本研究m⁶A振荡可能由mTORC1介导，且Rptor和Mlst8自身具有m⁶A变化，提示反馈调控可能。核心钟转录本与代谢转录本对MD反应差异的原因仍未知，可能涉及营养感知影响写入器靶向或不同阅读器参与，需未来直接检验。研究结论翻译：总体而言，研究人员的数据支持一个模型，其中甲硫氨酸剥夺改变甲硫氨酸和SAM的日间可利用性，伴随一部分既存m⁶A标记的节律性重塑。这些m⁶A变化与特定代谢和蛋白稳态相关转录本（包括Mat2a和Cbs）的丰度或翻译的选择性改变相关，提示m⁶A可能作为基因特异性的转录后组成部分，参与对甲硫氨酸剥夺的更广泛适应性反应。