METTL1介导的m7G修饰调控tRF-Lys-CTT生成并通过转录后抑制Uqcr10激活棕色脂肪组织产热

《Journal of Biological Chemistry》：An m7G tRNA-derived fragment mediated thermogenic activation of brown adipose tissue through post-transcriptional repression of Uqcr10

　　

肥胖、糖尿病及相关代谢紊乱已成为全球性流行病，主要由能量摄入与消耗失衡驱动。棕色脂肪组织（brown adipose tissue, BAT）是非战栗产热的主要场所，其激活可缓解肥胖及其代谢后果。RNA修饰是肥胖的重要调控因子。N7-甲基鸟苷（m7G）修饰广泛影响RNA稳定性、增强翻译效率，并有助于决定细胞命运。然而，m7G调控脂肪产热的具体机制尚不清楚。利用非靶向代谢组学，研究人员发现冷暴露激活了BAT中的产热代谢，且7-甲基鸟苷在产热激活的BAT中升高。METTL1介导的m7G修饰与脂肪产热激活呈正相关。METTL1缺失降低m7G水平并损害脂肪细胞的产热能力。同时，METTL1缺乏改变了tRNA切割模式，产生了调节基因表达的调控性tRNA衍生片段（tRNA-derived fragments, tRFs）。过表达源自m7G修饰tRNA的tRF-Lys-CTT会抑制棕色脂肪细胞分化和产热激活；相反，抑制tRF-Lys-CTT则产生相反效果。机制上，tRF-Lys-CTT与AGO2结合形成功能性RISC复合物，该复合物结合Uqcr10 mRNA的3'UTR并直接转录后抑制Uqcr10。在基础条件下，升高的tRF-Lys-CTT可能通过抑制Uqcr10表达来限制线粒体功能；而在冷刺激下，tRF-Lys-CTT的下调解除这种抑制，促进呼吸链超复合物组装和UCP1介导的产热作用。总之，该研究表明tRF-Lys-CTT作为代谢的转录后调控因子抑制产热，并为METTL1/m7G/tRF轴与产热控制之间的调控关系提供了新见解。

研究背景与科学问题

肥胖、糖尿病等代谢性疾病已成为全球性健康挑战，其根源在于能量摄入与消耗长期失衡。棕色脂肪组织（brown adipose tissue, BAT）是哺乳动物非战栗产热的核心器官，通过解偶联蛋白1（uncoupling protein 1, UCP1）介导线粒体质子漏，将化学能转化为热能，从而有效消耗多余能量。激活BAT的产热功能被认为是对抗肥胖及代谢紊乱的有效策略。以往研究主要聚焦于转录因子网络如PRDM16、PPARγ和PGC-1α对产热基因程序的启动与维持，但对于RNA修饰尤其是N7-甲基鸟苷（m⁷G）修饰如何调控脂肪产热，其具体分子机制仍不清晰。m⁷G修饰广泛存在于多种RNA中，尤其在tRNA中含量丰富，由甲基转移酶METTL1与辅因子WDR4组成的复合物催化形成，能够增强tRNA构象稳定性和翻译效率。此外，tRNA在应激条件下可被特异性核酸酶切割产生一类新型调控性小非编码RNA——tRNA衍生片段（tRNA-derived fragments, tRFs/tsRNAs），这些片段已被证实参与基因表达、翻译和表观遗传状态的调控。然而，METTL1介导的tRNA m⁷G修饰及其衍生的tRFs在脂肪组织能量代谢与产热激活中的精确调控角色尚未被充分探索。因此，本研究旨在阐明METTL1/m⁷G/tRF轴在BAT产热激活中的作用机制。

研究内容与结论

研究人员采用冷暴露诱导的小鼠BAT产热激活模型，结合体外棕色脂肪细胞分化体系，系统探究了m⁷G修饰在产热调控中的功能。研究发现，冷暴露显著上调BAT中METTL1的表达及整体RNA m⁷G修饰水平，且METTL1缺失会损害脂肪细胞的产热能力和线粒体功能。进一步发现，METTL1通过维持特定tRNA的稳定性，调控其衍生片段tRF-Lys-CTT的产生。tRF-Lys-CTT在BAT中低表达，而其在白色脂肪组织中高表达；功能实验表明，tRF-Lys-CTT通过结合Argonaute 2（AGO2）蛋白形成功能性RNA诱导沉默复合物（RISC），靶向结合Uqcr10 mRNA的3'非翻译区（UTR），在转录后水平抑制Uqcr10表达。Uqcr10是线粒体电子传递链复合体III的关键亚基，其下调导致线粒体膜电位降低、线粒体质量减少，进而抑制UCP1介导的产热作用。在冷刺激下，tRF-Lys-CTT水平下降，解除对Uqcr10的抑制，促进呼吸链超复合物组装和产热激活。该研究揭示了METTL1/m⁷G/tRF-Lys-CTT/Uqcr10这一全新信号轴在脂肪产热调控中的关键作用，为理解RNA表观转录组学修饰在能量代谢中的功能提供了新视角，也为开发针对肥胖及相关代谢综合征的治疗策略提供了潜在的分子靶点。

关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：1）非靶向代谢组学分析冷暴露小鼠BAT的差异代谢物谱；2）TRAC-seq技术绘制BAT和附睾白色脂肪组织（eWAT）中m⁷G修饰tRNA图谱；3）tRF & tsRNA-seq测序鉴定产热激活过程中差异表达的tRFs；4）Ribo-seq和RNA-seq联合分析BAT在冷暴露下的翻译组和转录组变化；5）双荧光素酶报告基因实验验证tRF-Lys-CTT与Uqcr10 3'UTR的直接结合；6）RNA免疫共沉淀（RIP）实验确认tRF-Lys-CTT与AGO2的物理互作。动物实验所用小鼠为C57BL/6品系，METTL1杂合敲除小鼠通过CRISPR/Cas9技术构建。

研究结果

1. 产热激活过程中METTL1介导的m⁷G修饰水平上调：通过RT-qPCR、Western blot和Dot blot分析发现，BAT中METTL1 mRNA和蛋白水平以及RNA m⁷G修饰水平均高于白色脂肪组织。冷暴露小鼠模型（4°C，48小时）成功建立后，BAT中METTL1、WDR4和UCP1表达显著上调，m⁷G修饰水平也明显升高，表明METTL1-m⁷G轴与全身产热激活密切相关。

2. 冷暴露触发BAT产热激活过程中的代谢差异：非靶向代谢组学主成分分析和偏最小二乘判别分析显示，冷暴露组与对照组BAT代谢谱显著分离。差异代谢物富集于脂质、有机酸及核苷酸类物质，其中S-腺苷-L-甲硫氨酸和7-甲基鸟苷显著上调，提示m⁷G相关代谢物在产热激活中发生动态变化。KEGG富集分析表明冷暴露主要影响氨基酸、碳水化合物和脂质代谢等能量底物代谢通路。

3. 棕色脂肪细胞产热与m⁷G水平正相关：在C3H10T1/2细胞分化的棕色脂肪细胞模型中，福斯柯林处理模拟冷刺激，显著上调产热标志基因UCP1、PGC-1α和COX8b表达，增加线粒体生物合成，同时提高METTL1和WDR4 mRNA水平及整体m⁷G修饰水平。METTL1敲低则显著降低m⁷G水平，抑制产热基因和脂解基因表达，减少UCP1蛋白和线粒体质量，并导致线粒体膜电位丧失。METTL1杂合敲除小鼠BAT中也观察到m⁷G水平下降。

4. METTL1介导的m⁷G修饰影响tRNA稳定性并调控产热相关tsRNAs生成：TRAC-seq鉴定出BAT与eWAT间226个差异表达的m⁷G修饰tRNA。tRF & tsRNA-seq显示，大部分tsRNAs源自成熟tRNA，其中57.4%来自携带m⁷G修饰的tRNA。tRF-Lys-CTT在BAT中显著下调，其预测靶基因富集于产热和氧化磷酸化通路。荧光淬灭报告系统实验证实，METTL1敲低促进tRNA-Lys-CTT的切割，而福斯柯林处理则降低切割产物，表明METTL1通过m⁷G修饰维持tRNA稳定性。

5. tRF-Lys-CTT抑制脂肪细胞分化和产热激活：RT-qPCR验证tRF-Lys-CTT在BAT中低表达，在白色脂肪组织中高表达，且冷暴露或福斯柯林处理可下调其水平。过表达tRF-Lys-CTT显著降低产热和脂解基因的mRNA和蛋白水平，减少UCP1表达、线粒体质量和膜电位，并抑制脂滴形成。抑制tRF-Lys-CTT则产生相反效应，促进产热基因表达和线粒体生物合成。

6. BAT产热激活过程中蛋白质翻译的差异图谱：Ribo-seq和RNA-seq联合分析显示，冷暴露诱导BAT在转录和翻译水平发生重编程。差异翻译蛋白富集于PPAR信号通路、脂肪酸代谢和糖酵解/糖异生等产热关键代谢通路。翻译效率分析表明，冷刺激引起广泛的翻译重塑，差异翻译效率基因主要富集于GTP结合、RNA剪接和核糖体生物合成等功能。

7. tRF-Lys-CTT通过靶向Uqcr10调控脂肪细胞产热激活：嘌呤霉素掺入实验显示METTL1敲低或tRF-Lys-CTT过表达均降低整体蛋白质合成。生信预测结合RT-qPCR筛选确定Uqcr10为tRF-Lys-CTT的下游靶基因。双荧光素酶报告基因实验证实tRF-Lys-CTT直接结合Uqcr10 3'UTR，且该作用依赖于AGO2蛋白。RIP-qPCR验证了AGO2与tRF-Lys-CTT及Uqcr10 mRNA的物理结合。Western blot显示tRF-Lys-CTT过表达或METTL1敲低均降低Uqcr10蛋白水平，而回补Uqcr10可逆转tRF-Lys-CTT对UCP1的抑制作用。Uqcr10敲低直接降低产热基因表达、线粒体质量和膜电位，表明Uqcr10是维持BAT产热激活所必需的。

讨论与结论总结

该研究将非编码RNA介导的翻译控制纳入脂肪产热调控范畴，揭示了tRNA衍生片段在脂质代谢重编程中的关键作用。研究发现，产热激活不仅涉及转录上调，还伴随着tRNA稳定性和切割动力学的显著重塑。冷暴露诱导的tRNA代谢变化创造了灵活的调控节点，使细胞能够快速调整蛋白质合成，弥补经典转录调控时间尺度较慢的不足。机制上，产热激活时METTL1介导的m⁷G修饰有效抑制tRNA切割，减少tRF-Lys-CTT积累；tRF-Lys-CTT通过与AGO2形成RISC复合物，在转录后水平抑制线粒体复合体III亚基Uqcr10的表达，从而限制线粒体功能和UCP1介导的产热。该研究拓宽了对tRNA表观转录组修饰和非编码RNA片段在代谢调控中功能的理解，确立了转录后RNA沉默作为控制脂肪产热的中心机制，并为操纵脂肪产热能力、干预肥胖及相关代谢综合征提供了新的分子靶点和理论基础。