核磁共振光谱揭示蛋白质精氨酸脱亚氨酶对组蛋白尾巴的差异化瓜氨酸化修饰

《Journal of Biological Chemistry》：Differential histone tail citrullination by protein arginine deiminases observed via NMR spectroscopy

瓜氨酸化是一种改变电荷的翻译后修饰（post-translational modification, PTM），即由钙离子激活的蛋白质精氨酸脱亚氨酶（protein arginine deiminases, PADs；EC 3.5.3.15）将蛋白质中的精氨酸转化为非编码氨基酸瓜氨酸。在人类中已知的五种PAD酶（PADs 1、2、3、4和6）呈差异化表达，并具有不同的蛋白质靶标，包括组蛋白。虽然部分PAD组蛋白瓜氨酸化位点已被知晓，但目前仍缺乏对具有催化活性的PADs 1-4所靶向的所有组蛋白尾巴精氨酸的全面研究。在此，研究人员试图在组蛋白肽段和重构核小体中鉴定PAD在组蛋白尾巴上的瓜氨酸化位点。为实现该目标，研究人员利用了基于实时¹H-¹⁵N核磁共振（NMR）光谱的检测方法。通过随时间监测精氨酸和瓜氨酸的骨架酰胺峰强度，研究人员在¹⁵N标记的组蛋白尾巴（存在于肽段及重构核小体核心颗粒中）上鉴定了瓜氨酸化位点。研究发现PADs 1、2和4能以不同程度瓜氨酸化所有可直接观测到的组蛋白尾巴精氨酸。这与PAD3不同，PAD3仅适度瓜氨酸化H2A和H4的精氨酸残基，且不修饰H3尾巴精氨酸。综上，这些数据表明每种PAD对组蛋白精氨酸具有一定的特异性。此外，与分离的肽段相比，核小体内的组蛋白尾巴瓜氨酸化发生改变，研究人员将此解读为反映了构象和可及性的差异。研究人员还推测瓜氨酸化增强了核小体组蛋白尾巴的动力学，这对组蛋白瓜氨酸化位点与尾巴内及尾巴间其他重要PTM调控位点（包括赖氨酸）之间的串扰具有潜在意义。

**研究背景与意义**

组蛋白翻译后修饰（post-translational modification, PTM）在染色质动态调控中发挥核心作用。核小体核心颗粒（nucleosome core particle, NCP）是染色质的基本结构单元，由约147 bp DNA缠绕组蛋白八聚体（H2A、H2B、H3、H4各两份）构成。组蛋白N端（以及H2A的C端）含有 intrinsically disordered regions（IDRs），即组蛋白尾巴，这些区域介导与染色质相关蛋白的相互作用以及核小体内外相互作用，并富含多种PTM位点。

瓜氨酸化是一种将蛋白质精氨酸残基转化为非编码氨基酸瓜氨酸的电荷改变型PTM，由钙依赖性蛋白质精氨酸脱亚氨酶（protein arginine deiminases, PADs；EC 3.5.3.15）催化，该反应不可逆，且目前尚无已知的“擦除器”（eraser）酶。人类中五种PAD同工酶（PADs 1、2、3、4、6）中除PAD6外均具有催化活性。PADs在时空上差异化表达，靶向不同蛋白质底物。组蛋白是PAD的重要底物类别，PAD4介导的中性粒细胞瓜氨酸化可导致染色质解凝，参与NETosis或失调性全局染色质解凝；PAD2瓜氨酸化与雌激素受体α下游基因的染色质解凝相关。然而，与赖氨酸乙酰化/甲基化等具有多种“阅读器”（reader）蛋白的表观修饰相比，目前仅有一个候选瓜氨酸“阅读器”蛋白被提出，且尚无“擦除器”酶，表明该修饰不可逆。尽管瓜氨酸化已被证实参与染色质组织与基因调控，但组蛋白瓜氨酸化的位点特异性图谱仍不完整。已有研究利用生化显色实验、抗体检测和质谱法鉴定瓜氨酸化位点，但这些方法各有局限：生化实验无法定位具体修饰位点；抗体缺乏位点特异性分辨率；质谱检测中+0.98 Da的微小质量位移难以与天冬酰胺/谷氨酰胺脱酰胺或天然丰度¹³C/¹⁵N掺入相区分。因此，目前缺乏针对每个具有催化活性的PAD在组蛋白尾巴上瓜氨酸化位点的系统性评估。

**研究内容与主要结论**

研究人员利用基于实时¹H-¹⁵N核磁共振（NMR）光谱的酶动力学检测方法，在组蛋白尾巴肽段和重构核小体两种背景下，同时追踪精氨酸衰减和瓜氨酸增长，系统鉴定了PADs 1-4在H2A、H2B、H3和H4组蛋白尾巴上的瓜氨酸化位点与相对速率。研究发现PADs 1、2和4能以不同程度瓜氨酸化几乎所有可直接观测的组蛋白尾巴精氨酸；PAD3则具有明显不同的底物特异性——不修饰H3尾巴精氨酸，仅适度修饰H2A和H4的特定精氨酸残基，但能修饰H3的R40/R42（位于H3-latch区域）。此外，在核小体背景下，瓜氨酸化导致组蛋白尾巴峰值强度广泛增加，提示瓜氨酸化减弱了尾巴与DNA的相互作用、增加了尾巴在皮秒-纳秒（ps-ns）时间尺度的动力学。这些发现揭示了不同PAD同工酶对组蛋白精氨酸的差异性识别，并提示瓜氨酸化可能通过增强组蛋白尾巴动力学来促进组蛋白尾部PTM串扰，进而影响染色质高级结构与基因调控，为理解瓜氨酸化在染色质调控中的表观遗传功能提供了分子层面的证据。

**关键技术方法**

研究人员使用的主要技术方法包括：①实时¹H-¹⁵N SOFAST-HMQC NMR光谱法，直接监测¹⁵N标记组蛋白底物中精氨酸峰衰减与瓜氨酸峰增长；②重组表达并纯化PADs 1-4酶，以及¹⁵N同位素标记的组蛋白尾巴肽段（H3(1-44)、H4(1-33) T30Y、H2A(1-28) F25Y、H2B(1-39)）；③利用Widom 601 DNA（147 bp）与单一组蛋白¹⁵N标记的组蛋白八聚体重构核小体核心颗粒（NCP）；④通过拟合精氨酸衰减和瓜氨酸增长曲线（线性、指数或Gompertz sigmoidal函数）计算50%完成时间（t_50%）。肽段实验在10°C下进行，NCP实验在25°C下进行，酶与底物摩尔比为1:500，含2 mM Ca²⁺。

**研究结果**

**基于NMR的检测方法实现组蛋白瓜氨酸化位点特异性监测**：研究人员建立了基于¹H-¹⁵N SOFAST-HMQC的实时检测体系，在单次实验中可同时分辨组蛋白尾巴上所有可见精氨酸的衰减和相应瓜氨酸的出现。肽段实验于10°C、NCP实验于25°C下进行，数据以t_50%作为定量比较指标。

**H3尾巴肽段评估：PADs 1、2和4瓜氨酸化H3尾巴**：利用¹⁵N-H3(1-44)肽段，PAD1在约9小时内完全瓜氨酸化R8、R17、R26、R40和R42；PAD2和PAD4也能瓜氨酸化所有直接可见精氨酸，但仅R8、R40和R42在实验时间内完全修饰。通过T3残基间接监测显示PAD1和PAD2可部分修饰R2，而PAD4无活性。PAD3不修饰H3尾巴真尾区任何精氨酸，但完全修饰R40/R42。比较各同工酶，R40/R42瓜氨酸化最快（t_50%约1-4小时），R17最慢（约4.5-16小时）。

**核小体H3尾巴底物评估：峰强度增加提示核小体尾巴动力学增强**：在¹⁵N-H3-NCP中，PADs 1、2和4对R8、R17和R26均有瓜氨酸化活性，其中PAD1整体最快；PAD3不引起精氨酸强度下降或瓜氨酸峰出现。值得注意的是，部分精氨酸-酶组合在衰变前出现先升后降的强度变化，非精氨酸残基强度也随时间增加，表明瓜氨酸化增强了H3尾巴在ps-ns时间尺度的动力学。

**H4尾巴肽段评估：PADs 1和4对H4尾巴瓜氨酸化效率最高**：利用¹⁵N-H4(1-33) T30Y肽段，PAD1在5小时内完全瓜氨酸化R3、R17、R19和R23；PADs 2和4完全修饰R3/R23但对R17/R19修饰较慢；PAD3主要修饰R3/R23，对R17/R19仅有微弱活性。

**核小体H4尾巴底物评估：瓜氨酸化使H4尾巴basic patch区域可见**：未修饰的¹⁵N-H4-NCP仅可见R3-A15残基。PAD处理后，四种PAD均瓜氨酸化R3，且随瓜氨酸化进行，K16-K20（basic patch）残基在谱图中变得可见，表明R3/R17/R19瓜氨酸化减弱了basic patch与DNA的相互作用，增加了尾巴动力学。PADs 1和4在约2小时内完全修饰R3/R17/R19，PAD2优先修饰R3，PAD3活性较弱。

**H2A尾巴肽段评估：PAD1对H2A尾巴瓜氨酸化效率最高**：利用¹⁵N-H2A(1-28) F25Y肽段，四种PAD均能在多个位点（R3、R11、R17、R20）表现出瓜氨酸化活性。PADs 1和2在实验时间内完全修饰所有四个精氨酸；PAD4完全修饰R3/R17/R20但R11未达完全；PAD3活性显著较慢。R20（非尾巴区域）是四种PAD的共同优先靶标。

**核小体H2A尾巴底物评估：瓜氨酸化使额外尾巴残基可见**：未修饰的¹⁵N-H2A-NCP中R3是唯一可见的精氨酸。PAD处理后，A10在所有PAD下变得可见，PAD1处理还使Cit11可见，说明瓜氨酸化增强了H2A N端尾巴动力学。PADs 1和4在实验时间内完全修饰R3，PAD1对R11的修饰最为显著。

**H2B尾巴肽段评估：尾巴邻近区域精氨酸被瓜氨酸化**：15N-H2B(1-39)肽段中R29/R31/R33被PAD1在约4小时内、PAD4在约5小时内完全瓜氨酸化；PAD2仅部分修饰，PAD3仅微弱修饰。

**核小体H2B尾巴底物评估：核小体尾巴强度增加**：由于H2B N端尾巴无精氨酸，研究人员追踪了K5、K11、K16、K20、K27五个赖氨酸乙酰化位点的强度变化。PAD加入后各赖氨酸强度缓慢增加，其中K27（最靠近核心）相对增幅最大。不同PAD引起的强度增长达峰时间不同（PAD4约1小时、PAD1约2小时、PAD2约4小时，PAD3在实验时间内未达平台），提示邻近组蛋白的瓜氨酸化增加了H2B尾巴的动力学。

**讨论与结论**

讨论部分指出，PADs 1、2、4对组蛋白尾巴精氨酸具有广泛而异的修饰能力，PAD3则表现出独特的底物限制性。基于PAD4与H4(1-10)、H3(4-13)、H3(14-23)肽段的共晶结构，PAD4与底物的相互作用涉及Q346和W347与' i-2 '残基主链羰基的作用、R374与' i-1 '和' i '主链羰基的作用等。序列比对显示PAD4中D344和Q346在其他PAD中不保守，可能贡献于同工酶的特异性差异。研究人员提出，PADs普遍不利于' i-1 '位为脯氨酸（如H3 R17）或无' i-2 '残基（如H3 R2）的底物。与先前报道一致，H3被PADs 1、2、4修饰，H4被不同程度修饰，H2A被PAD4修饰。核小体中瓜氨酸化引起的峰值强度增加与之前利用精氨酸-谷氨酰胺突变模拟电荷中和的实验结果一致，表明瓜氨酸化通过中和精氨酸正电荷减弱尾巴-DNA相互作用，使核小体尾巴平衡从不可及状态向可及状态转变（图12B），并可能通过PTM串扰促进同一或不同尾巴上后续修饰事件的进行。研究人员推测初始瓜氨酸化事件可增加后续修饰（包括瓜氨酸化或其他PTM）的速率，这可能导致核小体对额外表观遗传修饰更敏感，进而影响转录因子招募和DNA调控。此外，瓜氨酸化削弱组蛋白尾巴与邻近核小体DNA的强相互作用，可能促进染色质解凝，参与基因调控。研究还讨论了PAD激活所需的高浓度钙离子问题以及体内可能存在的调控机制。

研究结论：通过实时¹H-¹⁵N NMR酶动力学检测，本工作系统鉴定了PADs 1-4在组蛋白H2A、H2B、H3和H4尾巴上的瓜氨酸化位点。PADs 1、2和4可广泛瓜氨酸化所有可观察和可及的组蛋白尾巴精氨酸，但速率各异；PAD3仅瓜氨酸化H4 R3和H2A R3，不修饰H3尾巴精氨酸。核小体环境下瓜氨酸化增加了组蛋白尾巴的动力学，并可使原本不可见的区域（如H4 basic patch、H2A A10/Cit11）变为可见。这些发现揭示了PAD同工酶对组蛋白精氨酸的差异性识别性，支持瓜氨酸化通过增强尾巴动力学影响染色质结构和基因调控的模型，并为组蛋白瓜氨酸化与其他PTM之间的串扰提供了分子基础。