富集三萜皂苷的铁仔（Polyscias filicifolia）细胞悬浮培养：长期锥形瓶批次培养与生物反应器半连续模式下的生长参数与目标代谢物谱比较

《Journal of Biotechnology》：Polyscias filicifolia cell suspension culture enriched in triterpene glycosides: Growth parameters and target metabolite profile comparison of long-term in flasks batch culture and in a semi-continuous mode in bioreactor

　　

• 蕨叶南洋参（P. filicifolia）细胞培养的最大齐墩果烷糖苷含量超过了叶片。• 与植物叶片相比，细胞培养中含有更多高度糖基化的齐墩果烷糖苷。• 烧瓶和生物反应器培养细胞中的糖苷图谱相当相似。• 生物反应器中372天的培养伴随齐墩果烷糖苷含量的个体变化。• 在生物反应器中长期培养在生物量和生物活性物质含量方面可能不划算。

引言

现代制药、食品和化妆品行业对植物来源生物活性物质（BAS）的需求不断增长。这受到全球生态、健康营养趋势以及寻找化学合成产品天然替代品需求的推动（D'Amelia等，2021）。植物来源的BAS是新药物、类药功效化妆品、现代植物保护产品、功能性食品、动物饲料和饲料添加剂开发的基础（D'Amelia等，2021）。

野生、种植园和农业植物——传统的BAS来源——正难以满足日益增长的生产需求。这是由于一系列客观限制，包括某些珍贵植物物种的BAS生产力低、分布区域有限、植物生长缓慢或季节性、对气候条件和土壤因素的依赖，以及污染物富集的风险（Misra，2009；Cheng和Zhang，2026）。然而，许多BAS的完全化学合成往往因天然产物复杂的分子结构而不经济或不可能，这些结构通常含有多个手性中心和高度活泼的功能团，以及开发新策略和通常需要多步合成反应的高成本（Roberts等，2010）。

获得BAS的替代方法是利用离体植物细胞培养和植物组织技术。这种方法能够在严格控制条件下，不受外部因素影响，持续获得生化特性相对均一的植物生物量（Brodelius，1985；Murthy等，2016；Chandran等，2020）。目前，寻找和优化从珍贵植物物种生产特定BAS的生物技术平台是一个紧迫的科学和应用任务（Verpoorte等，2002；Yue等，2016；Murthy等，2016）。

具有广阔药理学活性谱的生物活性物质的便捷来源之一是蕨叶南洋参（Polyscias filicifolia (C. Moore ex E. Fournier) L.H. Bailey）。蕨叶南洋参，又称"蕨叶南洋参"（Divakar等，2010），属于五加科，是一种高达六米的常绿灌木。它主要作为观赏和药用植物在东南亚国家和热带太平洋岛屿上栽培（?liwińska等，2008；?liwińska等，2018；Chowdhuri和Deka，2019）。长期以来，这些地区一直将这种植物用于传统医学，特别是作为适应原和补剂。越南国家药典收录了蕨叶南洋参，确认了其价值（Furmanowa等，2002）。

对南洋参属植物，特别是蕨叶南洋参的植化成分的研究生仍然有限，但即使现有的数据也表明了其成分的丰富性。三萜糖苷（TGs），被认为是这些物种的主要BAS类群之一，已在叶片和根部中检测到（Vo等，1998；Ashmawy等，2020；?liwińska和Tomiczak，2025；Van Huyen等，2026）。这些糖苷的苷元通常是齐墩果烷型五环三萜类，如齐墩果酸和常春藤皂苷元，在某些情况下是大戟烷型化合物（?liwińska等，2018；?liwińska等，2021a；Ashmawy等，2020）。此外，还发现多炔类、甾醇、木脂素、氰苷以及一大类酚类化合物，包括类黄酮和酚酸（?liwińska等，2008；?liwińska等，2021a；?liwińska等，2022；Ashmawy等，2020）。

蕨叶南洋参中植化成分的多样性决定了其广泛的生物学活性。植物提取物表现出适应原、抗菌、免疫刺激和抗组胺活性，并对内分泌系统有影响（Ashmawy等，2020；Filaretov等，1986；Furmanowa等，2002；Marczewska等，2011）。从蕨叶南洋参中提取的TG组分显示出抗炎相关作用（Divakar等，2010）。齐墩果酸，南洋参属植物TGs的苷元，已显示出肝保护和心脏保护特性（?liwińska等，2021b）。此外，已证实蕨叶南洋参提取物具有抗氧化和抗遗传毒性活性，并能降低癌细胞的活力（Marczewska等，2011；?liwińska等，2018；?liwińska等，2021a；Figat等，2020）。值得注意的是，对离体植物和细胞培养物乙醇提取物的研究未发现任何遗传毒性和致突变活性，这为蕨叶南洋参细胞生物量的潜在应用提供了良好前景（Marczewska等，2011）。

尽管具有重要性，野生蕨叶南洋参植物作为原料的大规模使用受到其相对缓慢的生长和栖息地（热带或亚热带气候区域）的限制，以及目标代谢物含量随生长区域和植物发育阶段而变化的限制（?liwińska等，2008；?liwińska等，2021a）。这些限制应通过生物技术方法加以解决，以便生产具有稳定高产量BAS的标准化蕨叶南洋参植物原料。对蕨叶南洋参细胞的离体培养的兴趣早在20世纪70年代就已出现，当时首次获得了该物种的愈伤组织和细胞悬浮培养物（Slepyan等，1975a；Slepyan等，1975b）。最近继续进行了类似研究（?liwińska等，2008；Sukhanova等，2010）。此外，还获得了毛状根和芽培养物，这些培养物能够积累大量的酚类化合物（?liwińska等，2018；?liwińska等，2021b；?liwińska等，2022）。为增强芽培养物中次级代谢物，特别是酚类化合物和齐墩果酸的产量，成功使用了不同组合的茉莉酸甲酯、水杨酸和二腺苷5',5''-P1,P3-三磷酸作为激发子（?liwińska等，2021b）。还开发了利用芽顶分生组织作为胚胎性愈伤组织起始外植体的蕨叶南洋参体细胞胚胎发生高效微繁殖方法（?liwińska等，2008）。最后，在我们的部门，成功进行了蕨叶南洋参细胞（BFT-01-95菌株）在不同类型和体积的生物反应器中的培养，包括工业培养。该生物量被用于生产具有适应原和免疫调节特性的食品补充剂"Vitagmal"（Furmanowa等，2002；Klyushin等，2000；Titova等，2024a）。

尽管对大规模离体培养蕨叶南洋参细胞和器官的潜力及其后续实际应用有相当的兴趣，但仍缺乏关于目标TGs（即南洋参苷）在长期培养中生物合成保存方面的综合研究。具体而言，我们之前的工作集中在烧瓶内建立和常规维护蕨叶南洋参悬浮培养细胞菌株；但未对细胞生物量中目标TG含量变化或稳定性进行仔细研究（Sukhanova等，2012；Kochkin等，2014b）。蕨叶南洋参在不同类型和体积（最大630 L）生物反应器中生长的细胞悬浮培养物（CSCs）中南洋参苷的含量此前也未进行评估（Titova等，2024a）。

当然，建议从植物细胞培养发展的早期阶段开始研究BAS生物合成和生长参数的稳定性/变异性。使用在离体条件下维护多年，但生长和植化特征历史不明的细胞培养来解决这些问题将是错误的。

因此，本研究的目的是澄清四个主要问题。1）是否能获得生长参数与该物种以前获得的菌株相当的新的蕨叶南洋参CSC？2）新的蕨叶南洋参CSC（Pf-SH菌株）能否合成TG？3）在批次培养中，Pf-SH细胞的生长参数和TG图谱在几年内如何变化？4）在灌流-排水模式的生物反应器中，Pf-SH细胞的细胞形态、生长参数和TG图谱在长期（约一年）培养中如何变化？

植物材料

研究对象为蕨叶南洋参（C. Moore ex E. Fourn.）L. H. Bailey的CSC，即2019年从叶片来源愈伤组织获得的Pf-SH菌株。Pf-SH菌株保存在俄罗斯科学院植物生理研究所全俄高等植物细胞培养物收藏中（ARCCC HP IPPRAS）。为了进行化学对比和自由基清除活性（RSA）分析，使用了茨钦主植物园收藏中完整植物的叶片。

接种密度选择与批次培养中Pf-SH细胞的生长特性

经过四个月的较小聚集体筛选后，Pf-SH菌株由0.1–1毫米大小的较密集聚集体组成，由直径约20–30微米的圆形细胞形成。为了确定最佳接种物，研究了不同初始细胞密度（X0，基于DW）下Pf-SH细胞的生长特性。主要生长参数见补充表2。结果表明，随着X0从约0.5增加到约2.0克/升，生物量最大积累量（Xmax...

讨论

长期以来，植物细胞悬浮培养（CSCs）在生物技术应用中具有良好的前景，这是一个长期存在的范式（Brodelius，1985；Verpoorte等，2002；Yue等，2016；Chandran等，2020；Li和Hall-Ponselè，2025）。然而，限制植物CSCs广泛应用的问题之一是，关键问题是在长期培养过程中保持其生产特性的稳定性。已知植物CSC菌株的长期维护...

结论

我们对Pf-SH菌株在不同培养模式下长期传代过程中生长特性和目标BAS生物合成的研究，将为制定长期保存类似细胞菌株和提高其生产力的策略做出贡献，以满足工业用途。根据本研究的结果，可以认为，在工业生产中，Pf-SH细胞的中期生物反应器培养（不超过7–10个传代周期）将是最大化...的最佳策略。

缩写

BAS – 生物活性物质

CSC(s) – 细胞悬浮培养

DW – 细胞干重

FW – 细胞鲜重

MC – 多周期，即在生物反应器中带有多个传代周期的长期培养

RSA – 自由基清除活性

SCC(s) – 传代周期

TG(s) – 三萜糖苷

CRediT作者贡献声明

Maria V. Titova: 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，项目管理，调查研究，资金获取，概念化。

Olga N. Prudnikova: 验证，方法论，调查研究，形式分析。

Tatiana M. Tyurina: 可视化，软件，调查研究，形式分析，数据管理。

Artem A. Fomenkov: 资源，方法论，调查研究，数据管理。

Igor M. Ivanov: 资源，方法论。

Alexander V. Nosov: 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿。

资金

本研究在俄罗斯联邦科学与高等教育部国家任务（主题号126012615951-9）范围内进行。

利益冲突声明

作者声明他们不存在任何已知的竞争经济利益或个人关系，这些可能影响本论文所报告的工作。

Maria V. Titova | Olga N. Prudnikova | Tatiana M. Tyurina | Artem A. Fomenkov | Igor M. Ivanov | Alexander V. Nosov