通过蛋白二硫键异构酶a结构域介导的氧化折叠在大肠杆菌中高效生产重组人血清白蛋白

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Efficient production of recombinant human serum albumin in Escherichia coli via oxidative folding mediated by the a domain of protein disulfide isomerase

　　在大肠杆菌细胞质中高效生产折叠正确且富含二硫键的蛋白质仍然具有挑战性，因为细胞质呈高度还原性。本文我们通过将人蛋白二硫键异构酶（PDI）的α结构域与HSA的N端融合，开发了一种重组人血清白蛋白（rHSA）的表达系统。PDI（α）介导的cis融合使得在氧化型大肠杆菌菌株中、低温条件下实现了可溶性rHSA的高水平生产。纯化的大肠杆菌来源rHSA以单体形式为主，其分子量与含有17个分子内二硫键的HSA预期一致。大肠杆菌来源rHSA保留了与毕赤酵母（P. pastoris）来源rHSA（P. pastoris来源rHSA）及血清来源HSA相当的酯酶样活性，证实了该活性的保留。圆二色性分析和小角X射线散射结果表明，大肠杆菌来源rHSA的溶液结构几乎与P. pastoris来源rHSA相同。二硫键位点分析鉴定了17个天然二硫键中的13个，但也检测到了一些替代配对。在非还原条件下，大肠杆菌来源rHSA的热稳定性略低于P. pastoris来源rHSA。这些结果表明，PDI（α）介导的cis融合能够在细菌细胞质中高产率地生产结构接近天然且功能健全的HSA，并为在大肠杆菌中生产复杂的富含二硫键的蛋白质提供了一个实用平台。

分节摘要

材料

编码无标签HSA的cDNA（SC126343）购自OriGene Technologies（美国马里兰州罗克维尔）。编码人PDI的cDNA（ATCC No. 59478: pHTB）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。载体pET20b(+)、大肠杆菌感受态细胞、Amicon Ultra离心过滤器（10 kDa MWCO）和Millipore HP滤器（0.45 μm）购自Merck（德国达姆施塔特）。血清来源HSA（不含脂肪酸，琼脂糖凝胶电泳纯度≥99%）、在毕赤酵母中表达的rHSA（

人PDI的α结构域支持可溶性rHSA在大肠杆菌中的高水平表达

我们首先检测了在工程改造的大肠杆菌菌株Origami B(DE3)中的rHSA表达，该菌株携带硫氧还蛋白还原酶（trxB）和谷胱甘肽还原酶（gor）基因的突变。带C端His标签的rHSA在该菌株中几乎无法检测到表达（图1A，HSA–His-tag；图1B，泳道1–4）。我们随后尝试将rHSA与人PDI的α结构域（D18–T139）在其N端融合表达（图1A，His-tag–PDI(α)–CS–HSA）。在大肠杆菌中高产生产了大量的His-tag–PDI(α)–CS–rHSA。

讨论

在本研究中，我们证明在大肠杆菌细胞质中高效生产可溶性、含分子内二硫键的rHSA需要以下条件的协同作用：活性PDI（α）结构域以cis方式融合于HSA的N端、细胞内氧化环境以及低温表达条件。共表达PDI（α）–CS–HSA并未增强His-tag–PDI(α_m)–CS–HSA的表达（图S4），表明以trans方式在单独载体上提供的氧化还原活性PDI（α）结构域

CRediT作者贡献声明

Urada Reiko：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、验证、项目管理、方法学、调查研究、形式化分析、数据整理、概念构思。Yamaguchi Yuki：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、验证、方法学、调查研究、数据整理。Morishima Ken：撰写—初稿、可视化、验证、方法学、调查研究、数据整理。Maruno Takahiro：撰写—审阅与编辑，

生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的声明

在撰写本手稿过程中，作者仅使用ChatGPT（OpenAI）进行英文语言编辑和可读性改进。该工具未被用于生成科学数据、执行数据分析或得出科学结论。作者审阅并修改了所有AI辅助生成的文本，并对手稿内容承担全部责任。

致谢

我们感谢Yoshiki Nagashima和Daisuke Higo（Thermo Fisher Scientific）获取肽图谱数据。本研究由MEXT/JSPS KAKENHI资助（项目编号JP18H05229、JP18H05534、JP18H03681和JP21K18602）资助MS，并由京都大学综合放射线·核科学研究科项目研究基金（KURNS）资助。本研究还部分得到了先进材料科学与解析研究基础建设项目的资助。作者：Urada Reiko | Yamaguchi Yuki | Morishima Ken | Maruno Takahiro | Shimojo Saki | Okuda Aya | Uchiyama Susumu | Sugiyama Masaaki