《Journal of Biotechnology》：Bottom-up fabrication of redispersible β-1,3-1,6-glucan nanoparticle powders with enhanced aqueous solubility and improved macrophage responsiveness
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•自下而上的再水合化方法生成了可再分散的β-1,3–1,6-葡聚糖纳米颗粒粉末。•r-Glucan NP粉末保留了分子量及局部分支三螺旋结构特征。•r-Glucan NP粉末在水溶液中的表观溶解度最高可达约250 mM。•超声处理的t-glucan比r-glucan NP诱导
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自下而上的再水合化方法生成了可再分散的β-1,3–1,6-葡聚糖纳米颗粒粉末。
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r-Glucan NP粉末保留了分子量及局部分支三螺旋结构特征。
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r-Glucan NP粉末在水溶液中的表观溶解度最高可达约250 mM。
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超声处理的t-glucan比r-glucan NP诱导的TNF-α分泌量更弱。
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r-Glucan NP在冻干和再分散后仍保留了客体封装能力。
引言
β-葡聚糖等多糖凭借其结构多样性、生物可降解性和免疫学活性，作为生物相容性且可再生的生物材料受到了广泛关注（Murphy等，2023）。其中，源自真菌、海藻和酵母的β-1,3–1,6-葡聚糖因其独特的三螺旋构象而尤为引人注目，这种构象与生物识别和免疫相关反应密切相关（Meng等，2020）。特别是，据报道源自黑酵母的β-1,3–1,6-葡聚糖可在体外调节巨噬细胞反应（No等，2021）。然而，其固有的水溶性较差以及强烈的聚集倾向（Stahmann等，1995；Wang等，2001）长期以来限制了其在水性配方和生物材料领域的实际应用。本研究中，作为起始材料使用的天然三螺旋β-1,3–1,6-葡聚糖被称为天然t-glucan。
为了克服这些局限性，目前已开发出多种自上而下的策略和化学改性方法，将天然高分子量β-葡聚糖（包括天然t-glucan）转化为可分散的形式。酶解或超声降解可产生可溶性片段（Hua等，2022；Xin等，2022），机械破碎（如冷冻研磨）可制备基于β-葡聚糖的纳米颗粒材料（Chen等，2024），而磺化或羧甲基化等化学改性可提高溶解度（Li等，2024；Shin等，2007）。然而，这些方法通常涉及分子量降低、化学衍生化或改变葡聚糖的高阶组装结构。因此，仅仅改善水溶性并不一定能确保保留β-葡聚糖的可识别结构基序，也无法重现与特定纳米尺度葡聚糖组装相关的巨噬细胞反应性。
在我们此前的研究中，我们提出了一种自下而上的再水合化策略：将天然t-glucan在碱性条件下进行分子解离，随后通过控制中和重新组装为稳定的纳米颗粒（附图S1）（Kodama等，2020）。与传统的降解或衍生化方法不同，该方法依赖于分子自组装来重建水分散性纳米尺度葡聚糖组装体，同时保留与β-葡聚糖识别相关的局部分支三螺旋特征。所获得的纳米颗粒具有优异的水分散性，即使在16,000 g下离心后仍保持悬浮状态而不沉降。基于这些发现，我们将该再水合化过程与干态粉末化步骤相结合，获得了可再分散的β-葡聚糖纳米颗粒（r-glucan NP）粉末。粉末化在长期储存、运输以及按需制备方面具有实际优势，尤其适用于食品、营养保健品、化妆品及相关水性配方应用。
本研究旨在探讨通过自下而上再水合化得到的r-glucan NP能否在不影响其物理化学和功能性质的情况下转化为可再分散粉末。我们对r-glucan NP粉末的分子量、局部构象特征、表观长程有序畴贡献、再分散性、胶体稳定性、客体封装以及表观姜黄素的保留/释放行为进行了表征。为了区分水溶性改善和分子降解的影响与自下而上结构重组的影响，我们还制备了经超声处理的t-glucan作为自上而下的溶解性葡聚糖对照，并将其分子量、表观溶解分数、分散状态及巨噬细胞细胞因子反应与r-glucan NP进行了比较。此外，还通过细胞毒性测试、细胞因子分泌测定以及层兰竞争实验评估了巨噬细胞反应。该方法使我们得以考察：仅提高水溶性是否足以重现r-glucan NP的物理化学特性和体外巨噬细胞反应特征。
章节摘要
材料
姜黄素、瑞巴派特和层兰购自东京化学工业株式会社（日本东京）。白藜芦醇、丙酮、苯酚、硫酸、刚果红、脂多糖（LPS）、磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、青霉素-链霉素溶液（100 ×）以及N,N-二甲基甲酰胺（DMF）购自和光纯药工业株式会社（日本大阪）。胎牛血清（FBS）购自Vita株式会社（日本东京）。细胞计数
β-葡聚糖粉末的制备与表征
为阐明纳米颗粒制备、纯化和自上而下的超声处理如何影响物理化学性质，本研究制备或使用了四种β-葡聚糖粉末（图1和图2）。粉末1–粉末3源自同一批天然t-glucan，而粉末4由另一批天然t-glucan制备，用作自上而下的溶解性葡聚糖对照。
粉末1（t-glucan）：直接从发酵工艺中获得的天然β-1,3–1,6-葡聚糖，用作
结论
本研究建立了一种自下而上的制备策略，用于生产可再分散的β-1,3–1,6-葡聚糖纳米颗粒（r-glucan NP）粉末。碱-中和诱导的再水合化过程将天然t-glucan转化为纳米尺度组装体，保留了高分子量及局部分支三螺旋特征，同时干态粉末中来自长程有序畴的表观贡献较小。随后的冻干处理生成了可在中快速再分散的粉末。
CRediT作者贡献声明
小田真也（Ayumu Kodama）：方法学、调查研究、概念设计。西田康之（Yasushi Nishida）：验证、调查研究。三井正也（Masaya Miwa）：调查研究、验证。土井菜乃子（Nanako Doi）：验证、调查研究。本城良治（Ryoji Motoji）：验证、调查研究。铃木利夫（Toshio Suzuki）：资源获取。幸本和也（Kazuya Koumoto）：原稿撰写、项目管理、方法学、概念设计。
生成式AI及AI辅助技术在撰写过程中的声明
在手稿准备过程中，作者仅使用ChatGPT（OpenAI）来提升英文可读性和清晰度，包括语法、措辞和风格优化。该工具未被用于生成科学内容、解释结果或得出结论。手稿中的所有科学构思、数据解释及最终陈述均由作者构思并验证。在使用ChatGPT后，作者仔细审阅并核实了内容的准确性和完整性。
资金支持
本研究得到了日本柯南学园平尾太郎学术基金的支持。
利益冲突声明
幸本和也（Kazuya Koumoto）是B-Lab Co., Ltd.的首席执行官，该公司参与了本研究中讨论的基于β-葡聚糖的纳米材料的开发和商业化。所有其他作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者衷心感谢柯南大学准教授鹤冈隆彰（Takaaki Tsuruoka）在扫描电子显微镜（SEM）测量方面提供的帮助。
Ayumu Kodama|Yasushi Nishida|Masaya Miwa|Nanako Doi|Ryoji Motoji|Toshio Suzuki|Kazuya Koumoto
