《Journal of Biotechnology》：Antibody sequence diversity identified through multiple in-parallel NGS-based phage display panning campaigns
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人乳头瘤病毒（HPV）是最常见的性传播病原体之一，HPV16和HPV18是导致约70%HPV相关宫颈癌的两种高危型别。HPV L1蛋白可组装为病毒样颗粒（VLP），能诱导强效中和抗体反应。针对HPV L1蛋白的单克隆抗体对于检测方法开发和HPV疫苗研究至关重要
人乳头瘤病毒（HPV）是最常见的性传播病原体之一，HPV16和HPV18是导致约70%HPV相关宫颈癌的两种高危型别。HPV L1蛋白可组装为病毒样颗粒（VLP），能诱导强效中和抗体反应。针对HPV L1蛋白的单克隆抗体对于检测方法开发和HPV疫苗研究至关重要。噬菌体展示抗体片段文库可通过噬菌体淘选提供易于筛选的抗体，但传统Sanger测序通量低，限制了淘选后富集序列的鉴定。尽管Illumina等二代测序（NGS）平台部分解决了该问题，但其读长远短于人源Fab文库中抗体轻链和重链的总长度，使得NGS直接用于人源Fab文库分析面临挑战。第三代长读长测序平台PacBio和ONT可读取超过15 kb的片段，为跟踪每轮淘选后抗体序列多样性提供了可能。本研究利用HuCAL Platinum人源Fab噬菌体文库对HPV18 L1 VLP抗原进行四次平行淘选，通过PacBio和ONT两种长读长测序平台分析每轮淘选后的抗体基因序列，研究抗体序列多样性、种系使用、CDR3长度及ELISA结合活性。研究人员发现三轮淘选足以富集最高频率排名的抗体序列；PacBio与ONT平台在CDR-H3长度分布和重链种系使用上结果高度一致；琼脂平板与液体培养扩增的文库在抗体多样性上无显著差异；最高频率排名的抗体序列与ELISA表观EC50无显著相关性；四个平行淘选间的前25个高频序列中未发现共有序列。这些发现为优化噬菌体淘选策略提供了数据支持，表明在实验条件下三轮淘选即可获得最频繁的抗体序列，且当初始抗体面板不满足设计要求时，从初始文库重新开始额外淘选可产生更多样化的抗体序列面板。
研究背景与问题
人乳头瘤病毒（HPV）是最常见的性传播病原体之一，HPV16和HPV18两种高危型别导致约70%的HPV相关宫颈癌。HPV L1蛋白可自组装为病毒样颗粒（VLP），能激发强效中和抗体反应。针对HPV L1蛋白的单克隆抗体对检测方法开发和疫苗研究至关重要。噬菌体展示抗体片段文库通过噬菌体淘选可提供易于筛选的抗体，但传统Sanger测序通量低，难以全面鉴定淘选富集的抗体序列。二代测序（NGS）虽部分解决了通量问题，但其读长远短于人源Fab文库中抗体轻链和重链组合长度，限制了直接应用。第三代长读长测序平台PacBio和ONT可读取超过15 kb片段，为跟踪每轮淘选后抗体序列多样性提供了可能。本研究旨在通过多轮平行淘选结合长读长测序，系统评估抗体序列多样性、富集动态及最佳淘选轮数。
研究内容与结论
研究人员使用HuCAL Platinum人源Fab噬菌体文库对HPV18 L1 VLP抗原进行四次平行淘选，由两名研究人员各执行两次。通过PacBio和ONT两种长读长测序平台分析每轮淘选后的抗体基因序列，监测高频抗体序列的变化。结果显示三轮淘选足以富集最高频率排名的抗体序列，第四轮淘选未带来进一步改善。PacBio与ONT平台在CDR-H3长度分布和重链种系使用上高度一致，ONT成本约为PacBio的五分之一，是更具成本效益的选择。琼脂平板与液体培养扩增的文库在抗体多样性上无显著差异。前25个高频抗体序列中，第3轮与第4轮间重叠率达72%以上，但四个平行淘选间未发现共有序列。ELISA结果显示抗体频率排名与表观EC50无显著相关性，表明频率排名不能直接反映抗体结合活性。这些发现支持在实验条件下三轮淘选即可获得最频繁抗体序列，并为优化淘选策略提供了数据依据。
关键技术方法
本研究采用噬菌体展示文库淘选技术，将HuCAL Platinum人源Fab噬菌体文库与HPV18 VLP抗原孵育，经多轮淘选富集特异性抗体。长读长测序技术用于分析淘选产物，PacBio平台通过环化共有序列（CCS）实现高精度测序，ONT平台通过纳米孔单分子测序获得大量读段。生物信息学分析流程使用IgBLAST v1.22鉴定VH-VL组合和CDR-H3区域，排除含终止密码子或移码的序列，按频率排序抗体序列。抗体表达采用CHO-Express细胞瞬时转染系统，将筛选出的抗体序列转化为全长人源IgG1。ELISA用于评估抗体结合活性和特异性。
研究结果
3.1 NGS-Based Phage Panning
研究人员采用NGS-based phage panning工作流程，结合长读长测序分析四次平行淘选。四次淘选的噬菌体输出结果总体相似，第二轮因洗涤条件加强出现输出急剧下降，第三轮输出回升且四次淘选间水平接近，第四轮输出与第三轮持平，表明三轮淘选已达到富集效果。
3.2 PacBio versus ONT Long-Read Sequencing Platforms
未选择文库经PacBio和ONT测序分析，CDR-H3长度分布基本相同（KS效应量D=0.0000），重链种系使用几乎一致（KW效应量η2=0.0003）。CDR-H3长度范围为4至24个氨基酸，峰值约13个氨基酸，与MorphoSys发表结果一致。第3轮和第4轮淘选产物的频率排名在两种平台间高度一致，ONT作为更经济的平台与PacBio表现相当。
3.3 Sequencing of Library Amplified from Agar Plates or Liquid Cultures
研究人员比较了琼脂平板和液体培养扩增的噬菌体文库，结果显示两种培养条件下的CDR-H3长度分布基本一致（D=0.0000），重链种系使用也几乎相同（η2=0.0028），表明液体培养未引入明显的生长偏好或抗体序列偏差。
3.4 Three Rounds of Panning is Sufficient
第3轮和第4轮淘选的高频抗体序列中，CDR-H3长度偏好为10和11个氨基酸，两轮间CDR-H3长度分布相似。重链种系使用在两轮间几乎相同，VH1-69种系从初始文库的20-23%增至第3轮的34%和第4轮的36%，VH3-23从5%增至9%和14%，而VH5-51从20-24%降至9%和5%。第3轮和第4轮的前25个高频序列重叠率达72%以上，表明三轮淘选已足以鉴定最高频率排名的抗体序列。
3.5 No Common Sequences Found Among the Top Frequency-Ranked Antibodies from Four Parallel Panning Campaigns
四个平行淘选的第3轮和第4轮前25个高频抗体序列中，未发现任何共有序列。大多数高频序列为各淘选所独有，表明每次从初始文库开始的新淘选都能产生多样化的抗体序列面板。若初始抗体面板不满足设计要求，进行额外淘选可产生更多样化的抗体序列。
3.6 No Correlation Between Antibody Sequence Frequency Ranking and ELISA Binding Activity
研究人员表达了第3轮和第4轮的前15个高频抗体并测试ELISA结合活性。多数抗体对HPV18 VLP具有特异性结合，仅一个抗体与HPV45交叉反应。许多抗体EC50值低于150 ng/mL，对应亚纳摩尔级结合活性。但抗体频率排名与ELISA表观EC50无显著相关性（各淘选p>0.2，Spearman秩相关系数检验），表明频率排名不能预测抗体结合强度。
讨论与结论
本研究首次对多次平行噬菌体淘选结合NGS监测抗体序列频率和多样性进行了系统研究。第3轮和第4轮的前25个高频抗体序列间重叠率超过72%，但四个平行淘选间未发现共有序列。ELISA结果显示抗体表观EC50与频率排名无相关性。基于这些发现，研究人员认为在实验条件下三轮淘选足以鉴定最高频率排名的抗体序列。研究局限性包括：从单价Fab片段转化为二价IgG1分子可能改变表观结合亲合力，部分影响淘选富集与EC50测量间的相关性；匹配的淘选后琼脂和液体培养数据集未生成，无法进行直接比较；研究结果是否适用于较小多样性文库或不同复杂度抗原仍有待验证。当初始抗体面板不满足设计要求时，从初始文库重新开始额外淘选可产生更多样化的抗体序列面板。
