高细胞密度灌流培养强化腺病毒样颗粒（ADDomer）生产用于蛇咬伤治疗

《Journal of Biotechnology》：Process intensification for production of Adenovirus-like particles (ADDomer) as snake-bite therapy

　　

蛇咬伤是一种被忽视的公共卫生问题，每年导致高达14万人死亡。传统抗蛇毒血清（AVs）成本高昂（每疗程超过1000美元），限制了其在低收入国家的可及性。腺病毒样颗粒（ADDomer）作为一种基于多聚体蛋白的自组装纳米颗粒支架平台，可通过展示抗毒素表位中和血液中的蛇毒毒素，展现出替代传统抗蛇毒血清的潜力。ADDomer采用昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统（IC-BEVS）生产，但目前仅限于传统的分批生产模式，其规模化能力和产率受限。本研究旨在通过工艺强化提升ADDomer的生产效率。研究人员首先在低细胞密度（LCD）下优化了High Five和Sf-9两种昆虫细胞系的感染条件（细胞感染浓度CCI、感染复数MOI和收获时间TOH），并测定了葡萄糖（Glc）和谷氨酰胺（Gln）的细胞特异性消耗速率。基于此，研究人员在摇瓶中采用伪灌流策略，以每日2个反应器体积（VVD）的培养基置换速率，在High Five细胞于10×106 cell/mL和Sf-9细胞于20×106 cell/mL的高细胞密度（HCD）条件下，成功维持了与LCD相当的细胞特异性生产率。随后，研究人员在1 L搅拌槽生物反应器（STB）中，利用交替切向流（ATF）系统结合中空纤维进行细胞截留，验证了HCD灌流培养工艺。结果显示，相较于标准分批模式，High Five细胞的ADDomer体积产量提升了8倍，Sf-9细胞提升了6倍。空间时间产率（STY）分析表明，灌流生物反应器的效率优于伪灌流摇瓶和分批培养。纯化后的ADDomer颗粒经高效液相色谱（HPLC）、动态光散射（DLS）、SDS-PAGE、透射电子显微镜（TEM）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）表征，证实其理化性质和结构完整性得以保持，纯度超过91%。该研究证明，基于灌流的工艺强化能够有效克服IC-BEVS在高细胞密度下的细胞密度效应（CDE），显著提高ADDomer的体积产量，为蛇咬伤疗法的可扩展、低成本生产提供了可行方案。

论文解读文章

研究背景与科学问题

蛇咬伤是一种被忽视的热带疾病，全球每年致死人数高达14万，尤其在非洲、亚洲和拉丁美洲等医疗资源匮乏地区负担沉重。目前的治疗主要依赖从免疫马匹血浆中提取的抗蛇毒血清（AVs），但其有效性高度依赖于免疫所用 venom 的来源，且单次治疗成本可超过1000美元，对中低收入国家极不友好。因此，开发重组抗蛇毒制剂成为迫切需求。

腺病毒样颗粒（ADDomer）作为一种新型平台应运而生。ADDomer是基于多聚体蛋白自组装形成的纳米颗粒支架，能够在表面展示多种免疫原性抗原或其他分子。通过展示来自毒蛇的抗毒素表位，ADDomer有潜力中和血液循环中的蛇毒毒素，从而替代传统抗蛇毒血清。ADDomer采用昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统（IC-BEVS）进行重组生产，相比传统AVs，在制造可规模化和产量方面具有巨大优势。然而，目前ADDomer的生产仍局限于传统的分批培养模式，这种模式规模化能力有限、占地面积大、批次间差异大，且产率低于更先进的强化操作模式如灌流和连续培养。因此，亟需通过工艺强化来大幅提升ADDomer的生产通量，以满足全球抗蛇毒需求。

高细胞密度（HCD）生产是提高体积生产力的首选策略之一，即在≥10⁷ cell/mL的细胞培养物中表达重组蛋白。然而，HCD与IC-BEVS的结合常受限于细胞密度效应（CDE），即当细胞在高于标准1–3×10⁶ cell/mL的浓度下被感染时，细胞特异性生产力会下降。CDE的真正原因尚不清楚，但被认为可能与营养耗竭等多种因素有关。本研究旨在通过灌流技术补充耗竭的代谢物并洗脱有毒副产物，从而克服CDE，建立高产的ADDomer强化生产工艺。

主要关键技术方法

本研究采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   伪灌流摇瓶实验：在摇瓶培养中，通过定期离心完全更换培养基，模拟不同灌流速率（0.5、1、2 VVD），筛选最优的高细胞密度（HCD）感染条件。
2. 2.
   灌流生物反应器培养：在1 L搅拌槽生物反应器（STB）中，采用交替切向流（ATF）系统（XCell ATF-2）配合0.5 μm中空纤维作为细胞截留装置，实现连续灌流培养。
3. 3.
   产物纯化：通过阴离子交换层析（AEX）和切向流过滤（TFF）对ADDomer颗粒进行纯化。
4. 4.
   产物表征分析：运用高效液相色谱-体积排阻色谱（HPLC-SEC）测定分子量和纯度；动态光散射（DLS）测量粒径分布；SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹（Western blot）鉴定蛋白；透射电子显微镜（TEM）观察形态；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行肽段图谱分析以确认蛋白身份。

研究结果

3.1 确定最佳感染条件和营养需求以实现ADDomer高细胞密度生产

研究人员通过评估细胞感染浓度（CCI）、感染复数（MOI）和收获时间（TOH）等关键工艺参数，确定了低细胞密度（LCD）下ADDermer的最佳生产条件：High Five细胞为CCI=1×10⁶ cell/mL、MOI=1 pfu/cell、TOH=72 h；Sf-9细胞为CCI=2×10⁶ cell/mL、MOI=1 pfu/cell、TOH=72 h。在此基础上，计算了葡萄糖（Glc）和谷氨酰胺（Gln）的细胞特异性消耗速率，并模拟了在不同HCD场景下的营养耗竭时间。结果表明，High Five细胞代谢旺盛，在HCD下需要每天两次完全换液；而Sf-9细胞代谢较慢，在高达30–40×10⁶ cell/mL时营养耗竭时间仍在12–24小时内。

3.2 通过伪灌流精细调控HCD下的ADDomer生产

研究人员在摇瓶中实施伪灌流策略，以0.5、1或2 VVD的速率周期性更换培养基。对于High Five细胞，仅在VVD=2的条件下，无论CCI如何，Glc和Gln水平均保持在耗竭阈值以上。在此条件下，CCI为5或10×10⁶ cell/mL时，细胞特异性生产力与LCD相当，体积滴度提高了2–5倍。对于Sf-9细胞，在所有测试条件下营养均未耗竭，但仅在CCI=20×10⁶ cell/mL且VVD=2时，实现了最高的体积滴度提升倍数，同时保持了细胞特异性生产力。CCI达到30或40×10⁶ cell/mL时，未检测到ADDomer表达。最终确定的最优HCD条件为：High Five细胞CCI=10×10⁶ cell/mL，Sf-9细胞CCI=20×10⁶ cell/mL，两者均采用VVD=2。

3.3 从摇瓶到灌流生物反应器：验证HCD ADDomer生产

研究人员在1 L STB中采用ATF灌流模式验证了上述最优条件。对于High Five细胞，灌流培养实现了与标准分批工艺相当的细胞特异性生产力，体积滴度提升了8倍。对于Sf-9细胞，同样保持了细胞特异性生产力，体积滴度提升了6倍。空间时间产率（STY）分析显示，灌流生物反应器的STY显著高于伪灌流摇瓶和标准分批培养，分别高出2–8倍和26%–33%，证明了灌流生物反应器的独特优势。

3.4 HCD生产ADDomer的纯化与表征

研究人员对HCD灌流生物反应器生产的ADDomer进行了纯化和全面表征。HPLC-SEC分析显示，High Five细胞和Sf-9细胞生产的ADDomer颗粒分子量分别为3578 kDa和3567 kDa，与理论值约3.6 MDa一致，纯度分别达94%和91%。DLS确认了约32 nm的主导粒径。SDS-PAGE显示约60 kDa的优势条带，符合五邻体蛋白亚基的大小。LC-MS/MS肽段图谱分析确认了该条带主要为腺病毒五邻体蛋白（L2）。TEM成像验证了颗粒的正确尺寸、形态和结构完整性。

讨论与结论总结

讨论部分：本研究成功开发了一种基于灌流的强化工艺，用于生产ADDomer颗粒，以支持蛇咬伤疗法。通过在IC-BEVS平台中实施灌流工艺强化，研究人员证明在High Five细胞于10×10⁶ cell/mL和Sf-9细胞于20×10⁶ cell/mL的高细胞密度下生产ADDomer是可行的，细胞特异性生产力得以维持，体积滴度分别提升至8倍和6倍。这一策略不仅提高了生产效率，也顺应了行业向强化、连续生物制造的转型趋势。

成功的强化的关键在于针对细胞系特异性感染条件和培养基置换策略的精细调控。每日2 VVD的培养基置换率使High Five细胞能在10×10⁶ cell/mL的CCI下维持生产力，挑战了此前认为生产力在超过8–9×10⁶ cell/mL时会下降的观点。Sf-9细胞在20×10⁶ cell/mL下维持了生产力，但当密度升至30–40×10⁶ cell/mL时，尽管主要代谢物充足且副产物积累低，ADDomer表达却不可检测，表明CDE在此更高密度下超越了营养限制这一主要原因。

从经济角度看，STY分析证实灌流工艺比分批工艺在单位时间和单位培养基体积内产出更多ADDomer，更具成本效益。此外，灌流还能实现连续收获并与下游连续处理无缝集成。对HCD灌流生产ADDomer颗粒的质量评估（包括HPLC、DLS、SDS-PAGE、TEM和LC-MS/MS）证实其保留了预期的尺寸、形态和纯度，验证了该策略的稳健性。

结论部分：在本研究中，研究人员利用昆虫（High Five和Sf-9）细胞和BEVS平台，在高细胞密度（HCD）灌流生物反应器中成功开发了一种强化的ADDomer生产工艺。优化后的工艺在维持细胞特异性生产力的同时，显著提高了体积滴度，证明了基于灌流的策略在克服细胞密度效应方面的有效性。这些发现凸显了工艺强化在增强重组蛋白生产和支持ADDomer用于蛇咬伤等治疗应用的可扩展、低成本制造方面的潜力。该方法顺应了强化和连续生物制造的增长趋势，为未来整合到精简、高效的生产平台铺平了道路。