药物重定位小分子抑制剂靶向恶性疟原虫钙调蛋白并破坏Ca2+稳态

《International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance》：Repurposed Small-Molecule Inhibitors of Plasmodium falciparum Calmodulins Disrupt Calcium Homeostasis

　　

寄生虫特异性的钙调蛋白（calmodulin，CaM）界定了一个可成药的Ca²⁺信号模块；重定位的小分子抑制剂以微摩尔（μM）级亲和力直接结合疟原虫钙调蛋白；钙调蛋白抑制导致食物泡（food vacuole，FV）定向的Ca²⁺转运崩溃；Ca²⁺稳态的化学性破坏可阻断疟原虫发育。

疟疾仍是全球重大公共卫生挑战，2024年全球估计2.82亿病例和61万死亡，大部分负担集中在WHO非洲区域。青蒿素联合疗法（ACTs）虽为一线治疗，但耐药性的出现与传播正不断侵蚀现有药物疗效，因此迫切需要新作用机制的抗疟药物和寄生虫特异性靶点。钙信号在疟原虫生命周期中调控子孢子运动、裂殖子逸出和红细胞入侵等关键过程。恶性疟原虫（*Plasmodium falciparum*）具有独特的钙稳态维持体系，胞质Ca²⁺由内质网和酸性食物泡（food vacuole，FV）等细胞器摄取而严格调控。钙调蛋白（calmodulin，CaM）是真核生物中主要的Ca²⁺信号传感器，但疟原虫基因组同时编码多个钙调蛋白样旁系同源物，其中多数缺乏人类直系同源物，因而具有选择性药物靶点潜力。基于此，研究人员系统鉴定了恶性疟原虫中的钙调蛋白家族，并通过虚拟筛选和系列生化实验寻找可重定位的抑制剂，以期突破现有抗疟药物的耐药瓶颈。

研究人员首先利用PlasmoDB数据库鉴定出6个钙调蛋白/钙调蛋白样蛋白，并对其中3个进行了结构表征和功能验证。通过分子对接筛选了包含2525个FDA批准药物在内的2542个化合物，结合生物层干涉（bio-layer interferometry，BLI）、Ca²⁺结合实验、生长抑制实验和活细胞成像，最终确认Econazole、Carvedilol和Deschloro-Lapatinib三种重定位小分子抑制剂可直接结合疟原虫钙调蛋白，破坏其Ca²⁺结合功能，使食物泡靶向的Ca²⁺转运崩溃，并抑制寄生虫的发育。该研究揭示了疟原虫钙调蛋白家族作为可成药模块的价值，为抗疟药物开发提供了新的理论基础和候选化合物。

技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：利用PlasmoDB、TDR Targets和InterProScan进行基因组鉴定、结构域预测与正同源分析；使用ClustalW进行多序列比对；通过SWISS-MODEL、Robetta和AlphaFold3构建三维结构模型，并以Ramachandran图、ERRAT和Verify-3D评估模型质量；运用Schr?dinger Suite的Glide SP/XP模式进行分子对接筛选；将目标蛋白在*E. coli*中异源表达并纯化；采用BLI测定化合物–蛋白结合动力学；用显色钙测定法评估Ca²⁺结合和化合物干扰效应；用SYBR Green I荧光法测定对3D7、耐药株Dd2和MRA-1236的半数抑制浓度（IC₅₀）；通过红细胞预处理/洗脱实验区分寄生虫直接靶点与宿主红细胞效应；用Giemsa染色观察发育阶段阻滞；用Fluo-4 AM活细胞成像和免疫荧光（immunofluorescence assay，IFA）分析细胞内Ca²⁺分布和亚细胞定位。样本来源方面，人O⁺红细胞来自印度新德里Rotary血库，所有动物实验经ICGEB动物伦理委员会批准。

研究结果如下：

3.1 恶性疟原虫基因组中六个钙调蛋白及钙调蛋白样蛋白的鉴定与结构分析
研究人员通过PlasmoDB基因组注释检索，鉴定出6个钙调蛋白/钙调蛋白样蛋白基因（PF3D7_0414200、PF3D7_0714400、PF3D7_1030800、PF3D7_1418300、PF3D7_1434200和PF3D7_1444200）。所有蛋白均含一个或多个EF-hand Ca²⁺结合基序。TDR Targets正同源分析显示，除PfCam200（PF3D7_1434200）外，其余5个蛋白在人类基因组中均无直系同源物；PfCam200与人类钙调蛋白的序列同一性为89.26%。结构建模和Ramachandran图验证后，研究人员选择晶体结构可用的PfCam200以及Robetta模型质量最佳的PfCam300（PF3D7_1418300）和PfCam400（PF3D7_0714400）用于后续生化研究。

3.2 分子对接研究鉴定出六种恶性疟原虫钙调蛋白选择性抑制剂
以PfCam200晶体结构（PDB:8AHT）、人类钙调蛋白结构（PDB:2R28）和PfCam300/PfCam400的Robetta模型为受体，研究人员对2542个化合物进行了Glide SP/XP对接。结果显示，Carvedilol、Nadolol和Oxybutynin对PfCam200表现出较人类钙调蛋白更优的结合能，其中Carvedilol的XP GScore为-8.150 kcal/mol，而人类钙调蛋白仅为-3.505 kcal/mol。Econazole、Deschloro-Lapatinib和Rosuvastatin则主要靶向PfCam300和PfCam400。综合打分和相互作用分析，共选出6个化合物进入实验验证。

3.3 恶性疟原虫钙调蛋白的表达纯化及与六个候选化合物的BLI结合分析
研究人员成功在*E. coli*中表达纯化了PfCam200（约16 kDa）、PfCam300（约15 kDa）和PfCam400（约30 kDa）。BLI实验表明，Econazole和Deschloro-Lapatinib可分别与PfCam300和PfCam400产生浓度依赖性结合，Carvedilol可与PfCam200结合；三者平衡解离常数（K_D）介于2.70×10^-6 M至5.4×10^-5 M之间。相比之下，Nadolol、Oxybutynin和Rosuvastatin在所有测试浓度下均未观察到可重复的结合响应，因此未进入后续功能实验。

3.4 钙调蛋白/钙调蛋白样蛋白的Ca²⁺结合功能验证及先导化合物对其影响
钙结合实验显示，三种重组PfCam蛋白均能以浓度依赖方式减少可检测游离Ca²⁺，证实其Ca²⁺结合活性。在加入Carvedilol、Econazole或Deschloro-Lapatinib后，游离Ca²⁺出现不同程度升高，表明化合物的结合干扰了蛋白的Ca²⁺保留能力；其中Carvedilol的作用最强。生长抑制实验中，化合物对3D7株的IC₅₀分别为Carvedilol 7.18 μM、Econazole 15.47 μM、Deschloro-Lapatinib 4.44 μM。在耐药株Dd2和MRA-1236中，Carvedilol和Econazole仍保持活性，但Deschloro-Lapatinib在Dd2中IC₅₀升至61 μM。红细胞预处理/洗脱实验表明，Carvedilol和Econazole的抗疟活性主要来自对寄生虫的直接作用，而Deschloro-Lapatinib还依赖对宿主红细胞的持续性影响。同步化发育实验显示，Econazole将寄生虫阻滞于早期环状体阶段，Carvedilol和Deschloro-Lapatinib则主要在滋养体至裂殖体阶段引起形态异常。

3.5 活细胞钙成像和亚细胞定位揭示恶性疟原虫无性期钙稳态改变
Fluo-4 AM活细胞成像显示，未处理对照寄生虫在食物泡区域具有显著的荧光积累；经Econazole、Carvedilol或Deschloro-Lapatinib处理后，寄生虫整体荧光强度降低或分布变得弥散，提示细胞内Ca²⁺区室化发生改变。免疫荧光实验显示，PfCam200、PfCam300和PfCam400均与食物泡膜转运体PfCRT和PfMDR1存在部分空间重叠，Pearson相关系数为0.67–0.86，三维重建进一步支持这些钙调蛋白位于食物泡近端区域。

3.6 重定位钙调蛋白抑制剂破坏恶性疟原虫Ca²⁺稳态的整合机制模型
综合生化、成像和表型数据，研究人员提出如下模型：在正常条件下，PfCam蛋白作为Ca²⁺伴侣将胞质Ca²⁺递送至食物泡，并由PfCRT/PfMDR1参与维持Ca²⁺储积。抑制剂与PfCam蛋白的EF-hand区域结合后，干扰其Ca²⁺捕获和递送功能，导致食物泡无法正常摄取Ca²⁺，胞质游离Ca²⁺异常升高，最终造成寄生虫钙稳态崩溃和发育停滞。

讨论部分指出，钙信号是恶性疟原虫的重要调控枢纽，而寄生虫钙调蛋白家族的序列多样性和缺乏人类同源物的特征使其具备选择性成药潜力。不过，BLI测得的结合亲和力与钙结合实验中功能变化程度并不完全一致，说明配体结合与功能效应是互补但不同的属性。经典钙调蛋白拮抗剂Calmidazolium chloride（CDZ）的Ca²⁺释放谱也与本研究化合物不同，提示不同抑制剂可能通过不同构象机制发挥作用。尽管化合物在耐药株中仍具活性，但其抗疟机制可能涉及多靶点效应，Deschloro-Lapatinib还存在宿主红细胞成分，因此未来需要通过化学蛋白质组学、细胞热位移分析或化学基因组耐药图谱等方法进行全面的靶点去卷积。此外，化合物对人类钙调蛋白的活性、细胞毒性和体内药效仍需进一步评价。

研究结论翻译：本研究在恶性疟原虫中鉴定并表征了钙调蛋白及钙调蛋白样蛋白，并证明所选重定位化合物可直接与三种重组PfCaM蛋白相互作用并干扰其Ca²⁺结合活性。这些化合物抑制无性期寄生虫生长，并伴随细胞内Ca²⁺分布和寄生虫发育的改变。免疫荧光分析进一步显示PfCam200、PfCam300和PfCam400与食物泡膜标志物PfCRT和PfMDR1存在部分空间重叠，但现有数据尚未确定PfCam蛋白与这些转运体的直接相互作用，也未确定PfCRT/PfMDR1在Ca²⁺处理中的功能角色。这些观察为今后研究PfCam相关Ca²⁺调控提供了可检验的假说，并为靶向这一网络的抗疟药物开发奠定了基础。