《International Journal of Pharmaceutics》：Nebulization-stable lipid–polymer hybrid nanoparticles for mRNA delivery in advanced
in vitro respiratory models
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摘要专业翻译
信使RNA（mRNA）的肺部递送为局部疫苗接种和治疗呼吸系统疾病提供了一种有前景的策略，但雾化应激和气道屏障仍是主要障碍。在此，研究人员开发了由固体聚乳酸（PLA）核心和工程化脂质冠组成的无聚乙二醇（PEG）脂质-聚合物杂合纳米颗粒（mucLPs
摘要专业翻译
信使RNA（mRNA）的肺部递送为局部疫苗接种和治疗呼吸系统疾病提供了一种有前景的策略，但雾化应激和气道屏障仍是主要障碍。在此，研究人员开发了由固体聚乳酸（PLA）核心和工程化脂质冠组成的无聚乙二醇（PEG）脂质-聚合物杂合纳米颗粒（mucLPs）。通过改变脂质组成筛选了九种配方，并评估了其理化性质、mRNA结合能力、细胞相容性、振动网筛雾化过程中的稳定性及转染效率。先导配方mucLP3兼具高mRNA结合率和负性负载后表面电荷，且在雾化后保持了粒径分布和报告基因活性。相比之下，在相同条件下测试的基于SM-102的参考脂质纳米颗粒（LNP）在雾化后出现聚集和报告基因表达降低。未经雾化的mucLP3还能在气道上皮细胞系、小鼠肺类器官以及维持于气-液界面（ALI）的原代人气道上皮培养物中支持mRNA表达。这些数据为一种无PEG脂质-聚合物杂合架构建立了概念验证，该架构耐受所测试的雾化程序，并在复杂度递增的呼吸道模型中保持功能性。直接黏液转运测量、气溶胶沉积研究以及体内疗效研究将需要用以确定肺部递送性能。
论文解读文章
一、研究背景与问题
mRNA疗法已成为疫苗和蛋白替代治疗的重要方式，脂质纳米颗粒（LNP）的成功系统应用推动了这一领域的发展。然而，将mRNA递送扩展至黏膜组织尤其是呼吸道仍面临重大挑战。直接肺部给药通过气管内滴注或雾化吸入可实现精确的局部沉积，减少脱靶效应，但存在两大核心障碍：其一，气道表面覆盖着致密、黏弹性且不断更新的黏液凝胶，可捕获吸入颗粒和微生物，限制纳米颗粒到达上皮表面；其二，雾化过程使纳米颗粒暴露于剪切力和反复的气-液界面，可能诱导聚集、脂质重排或功能性核酸递送能力的丧失。此外，传统的聚乙二醇（PEG）修饰虽可改善胶体稳定性和黏液穿透性，但致密的PEG层可能降低细胞表面相互作用和胞内递送效率，且重复暴露可引发抗PEG抗体。因此，亟需开发一种兼具高效mRNA复合能力、抗雾化机械应力且与肺部微环境相容的递送系统。
二、研究内容与结论
研究人员开发了一种无PEG脂质-聚合物杂合纳米颗粒系统（mucLPs），由预成脂质体吸附于固体聚乳酸（PLA）核心构成。PLA核心提供稳定支架，脂质冠层独立调控mRNA结合和细胞相互作用。通过系统筛选九种脂质组成，mucLP3被确定为先导配方，其具有最高的mRNA吸附效率（90–98%）、稳定的纳米尺度粒径和负性负载后表面电荷。在振动网筛雾化测试中，mucLP1–3在雾化后保持了粒径分布、低多分散指数和报告基因活性，而基于SM-102的参考LNP出现聚集和表达显著下降。未经雾化的mucLP3在A549和Calu-3气-液界面（ALI）细胞系、小鼠肺类器官及原代人气道上皮（HAE）ALI培养物中均实现了功能性mRNA递送，且未检测到显著细胞毒性和促炎细胞因子分泌。该研究建立了无PEG杂合架构用于呼吸道mRNA递送的体外概念验证。
三、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：通过纳米沉淀法制备PLA纳米颗粒核心；利用微流控技术制备不同脂质组成的脂质体；将PLA核心与脂质体在70°C下孵育组装形成mucLPs；采用动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）表征粒径、多分散指数和zeta电位；使用冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）观察颗粒形态；采用RiboGreen?法量化mRNA吸附效率；使用Aerogen? Solo振动网筛雾化器进行雾化稳定性测试；构建了多种体外呼吸道模型，包括A549和Calu-3细胞系ALI培养、小鼠肺类器官（来源于Charles River Laboratories提供的12周龄小鼠肺组织）以及原代人气道上皮ALI培养（人肺组织来自法国HCL生物样本库，已获患者知情同意和法国MESRI授权）；通过荧光显微镜、共聚焦显微镜和流式细胞术评估转染效率；采用PrestoBlue?和LDH检测评估细胞毒性；使用MSD V-PLEX试剂盒定量促炎细胞因子。
四、研究结果
4.1 脂质-聚合物杂合纳米颗粒配方的理化表征与筛选
研究人员将四种脂质——可电离脂质D-Lin-MC3-DMA、阳离子脂质DOTAP、辅助磷脂DOPE和结构磷脂DPPC——组合成九种脂质体配方。所有脂质体均自组装为50–90 nm的纳米囊泡。组装为mucLPs并负载mRNA后，配方间出现显著差异：多数配方出现粒径增大至微米级和PDI升高，而mucLP1–3保持了约200–250 nm的稳定纳米尺寸和低PDI。mRNA吸附引起表面电荷从约+45至+55 mV反转为负值，证实了核酸的有效吸附和表面屏蔽。mucLP3实现了最高的mRNA吸附效率（90–98%），被确定为先导配方。
4.2 脂质-聚合物杂合纳米颗粒的细胞相容性
在HeLa细胞中使用PrestoBlue代谢检测评估细胞相容性，三种候选配方均未显著降低代谢活性，验证了优化脂质组成和组装策略的生物学耐受性。
4.3 雾化保持mucLP配方的结构完整性和功能活性
使用Aerogen Solo振动网筛雾化器评估mucLP1–3和SM-102参考LNP的雾化稳定性。mucLP1–3在雾化后保持了稳定的纳米尺寸和低PDI，zeta电位仅有微小变化；参考LNP则出现粒径增大、分散度升高和表面电荷较大偏移。功能检测表明，mucLP1–3在雾化后保留了与雾化前相当的荧光素酶报告基因表达活性，而参考LNP的表达显著下降。
4.4 气道上皮细胞模型中的高效持续mRNA递送
在A549（非黏液分泌肺泡模型）和Calu-3（黏液分泌支气管模型）ALI培养中评估eGFP表达。mucLP3在两种细胞系中均表现出最有效的转染，尤其在黏液分泌型Calu-3中于24小时出现强烈eGFP表达。流式细胞术定量显示，在A549中mucLP3的阳性细胞百分比低于参考LNP（约5%对30–40%），但平均荧光强度（MFI）显著更高；在Calu-3中mucLP3产生约5–10%的eGFP阳性细胞且荧光强度更高，而参考LNP接近基线水平。LDH检测显示A549中细胞毒性低于5%，Calu-3中未检测到细胞毒性。
4.5 高级呼吸道模型中的功能性mRNA递送
小鼠肺类器官暴露于mucLP3后，共聚焦显微镜证实了BODIPY TR600标记的纳米颗粒被类器官内细胞摄取，同时观察到eGFP表达，证明纳米颗粒摄取实现了胞内递送和表面吸附mRNA的功能性翻译。在原代人气道（HAE）ALI培养中，mucLP3实现了eGFP表达，LDH释放低于3%，且IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子分泌与缓冲液对照相比无显著增加。
五、讨论与结论
讨论部分指出，mucLP3从九种配方的筛选中脱颖而出，基于三项发现：高mRNA结合率（90–98%）、雾化后保持胶体性质和报告基因活性、以及跨细胞系ALI培养、小鼠肺类器官和原代HAE-ALI培养的报告基因表达。该研究扩展了既往吸入RNA递送方法，其独特贡献在于将恒定固体PLA支架与系统脂质冠优化相结合、无PEG设计、雾化前后配对功能比较以及在分化呼吸道模型中的测试。脂质组成强烈影响组装和生物学性能：DOTAP支持静电mRNA结合，D-Lin-MC3-DMA促进pH依赖性内体逃逸，DOPE有利于膜去稳定的非层状相形成，DPPC作为表面活性剂相关结构磷脂。A549与Calu-3的对比凸显了生物学环境对配方性能的影响：参考LNP在A549中转染更大比例的细胞，而mucLP3在每个转染细胞中产生更高表达，并在黏液分泌型Calu-3中表现更优，表明mucLP3的优势具有情境依赖性。约250 nm的mRNA负载mucLP尺寸处于与黏液转运相容的范围，负载后zeta电位转为负值可能减弱与阴离子黏蛋白的静电相互作用，但直接黏液转运研究仍需确定其穿透效率。
研究结论为：研究人员开发了一种无PEG脂质-聚合物杂合纳米颗粒系统，并确定mucLP3为先导配方，具有高mRNA结合率、稳定的胶体性质以及振动网筛雾化后保持的报告基因活性。未经雾化的mucLP3还在细胞系ALI培养、小鼠肺类器官和原代HAE-ALI培养中实现了定性报告基因表达，展示了其在复杂度递增的呼吸道模型中递送功能性mRNA的能力。这些结果建立了该杂合纳米颗粒系统用于呼吸道mRNA递送的体外概念验证。进一步阐明黏液转运机制、在高级肺部模型中进行定量转染评估以及体内研究，对于全面评估该平台及其呼吸道mRNA递送的转化潜力至关重要。
