《Emerging Microbes & Infections》：Successful long-term in vitro cultivation of Treponema pallidum subsp. pertenue strains of human and non-human primate origin
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胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤，尽管采用手术、放疗和替莫唑胺（temozolomide, TMZ）化疗的标准方案，患者中位生存期仍仅为14至16个月。放疗（radiotherapy, RT）是术后
胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤，尽管采用手术、放疗和替莫唑胺（temozolomide, TMZ）化疗的标准方案，患者中位生存期仍仅为14至16个月。放疗（radiotherapy, RT）是术后最重要的治疗手段之一，然而GBM固有的及获得性放疗耐药严重限制了其疗效。为系统鉴定介导GBM放疗耐药的关键分子靶点，研究人员利用CRISPR-Cas9全基因组功能缺失筛选技术，在放疗处理条件下识别出多个候选耐药基因，其中以USP28（ubiquitin-specific protease 28）最为显著。研究发现，USP28通过去泛素化稳定MDC1（mediator of DNA damage checkpoint 1）蛋白，从而促进DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）损伤修复信号通路的激活，增强GBM细胞对电离辐射（ionizing radiation, IR）的抵抗能力。在体外及原位异种移植小鼠模型中，敲低或药理学抑制USP28均能显著增加GBM细胞对放疗的敏感性，延缓肿瘤生长并延长荷瘤小鼠生存期。此外，研究人员还发现USP28在GBM临床样本中高表达，且其表达水平与患者放疗反应及预后不良显著相关。该研究揭示了USP28-MDC1轴作为GBM放疗耐药核心调控机制的新功能，为开发针对放疗增敏的靶向治疗策略提供了坚实的理论依据和候选药物靶点。
一、研究背景与科学问题
胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，具有高度侵袭性和遗传异质性。当前标准治疗方案为手术切除后联合放疗和替莫唑胺化疗，但患者预后极差，中位生存期不足16个月。放疗通过诱导DNA双链断裂（DSBs）发挥细胞毒性作用，是GBM术后治疗的核心手段。然而，GBM细胞固有的DNA损伤修复能力增强及放疗诱导的适应性耐药，是导致肿瘤复发和治疗失败的关键原因。因此，系统解析GBM放疗耐药的分子机制，寻找可干预的靶点以增强放疗敏感性，具有重要的临床转化价值。既往研究多聚焦于单个基因或信号通路，缺乏全基因组水平的功能筛选，难以全面揭示耐药调控网络。
二、研究内容与主要结论
研究人员采用CRISPR-Cas9全基因组功能缺失筛选技术，在放疗处理条件下鉴定GBM细胞存活所必需的关键基因，发现去泛素化酶USP28为候选耐药基因。机制研究表明，USP28通过去泛素化并稳定MDC1蛋白，促进DNA损伤应答（DDR）中DSB修复信号的放大，增强非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）修复效率，从而赋予GBM细胞放疗抵抗能力。在体外细胞模型和原位异种移植小鼠模型中，敲低USP28或使用其小分子抑制剂均显著提高GBM细胞对电离辐射的敏感性，抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠生存期。临床样本分析显示，USP28在GBM组织中高表达，且其表达水平与患者放疗反应差及总生存期缩短显著相关。该研究首次从全基因组水平揭示USP28-MDC1轴是GBM放疗耐药的核心调控节点，为开发放疗增敏靶向药物提供了新思路。
三、关键技术方法
研究人员主要运用了以下关键技术：
- 1.
CRISPR-Cas9全基因组功能缺失筛选文库，用于在放疗压力下鉴定影响GBM细胞存活的关键基因；
- 2.
蛋白质互作与去泛素化实验，包括免疫共沉淀（co-IP）和泛素化检测，用于验证USP28与MDC1的相互作用及去泛素化修饰；
- 3.
DNA损伤修复功能分析，包括γ-H2AX焦点形成检测和报告基因系统，用于评估DSB修复效率；
- 4.
原位异种移植小鼠模型，用于评估USP28敲低或抑制对肿瘤放疗敏感性的影响；
- 5.
临床GBM组织样本队列的免疫组化和生存分析，用于验证USP28表达的临床相关性。
四、研究结果分述
1. 全基因组筛选鉴定USP28为放疗耐药关键基因
通过CRISPR-Cas9文库筛选，在放疗处理下比较存活细胞中sgRNA丰度变化，富集出多个与DNA修复和细胞周期调控相关的候选基因，其中USP28敲除显著降低GBM细胞放疗存活率，提示其为潜在耐药调控因子。
2. USP28通过稳定MDC1增强DSB修复
研究发现USP28直接结合MDC1并去除其K48连接的泛素化修饰，抑制MDC1的蛋白酶体降解，从而增强MDC1在DSB位点的聚集，促进下游修复蛋白招募，提高DSB修复效率。
3. USP28敲低或抑制增强GBM放疗敏感性
在多个GBM细胞系中，shRNA介导的USP28敲低或小分子抑制剂处理，均显著增加放疗诱导的细胞凋亡和克隆形成抑制。原位小鼠模型中，联合USP28抑制与放疗显著延缓肿瘤生长并延长生存期。
4. USP28高表达预示GBM患者放疗抵抗及不良预后
临床队列分析显示，USP28蛋白表达水平在GBM组织中显著高于正常脑组织，且高表达组患者接受放疗后的无进展生存期和总生存期均显著缩短，多因素分析确认USP28为独立预后不良因素。
五、讨论与结论
讨论部分指出，该研究将USP28-MDC1轴确立为GBM放疗耐药的新机制，拓展了对DDR调控网络的认识。USP28作为去泛素化酶，其可成药性为开发靶向放疗增敏药物提供了理想靶点。研究同时提出，USP28抑制剂与放疗联合应用可能克服GBM耐药，但仍需进一步评估其毒性及血脑屏障穿透性。结论部分明确，USP28通过去泛素化稳定MDC1促进DSB修复，是GBM放疗耐药的关键驱动因子；靶向USP28可有效增敏放疗，为改善GBM患者预后提供了新的治疗策略。
