欧洲生物分析论坛关于新兴小分子药物模态的跨行业视角：生物分析挑战与潜在缓解策略

《Bioanalysis》：European Bioanalysis Forum cross-industry perspective on emerging small-molecule modalities: bioanalytical challenges and potential mitigation strategies

　　

摘要专业翻译 摘要 新兴小分子药物模态，包括寡核苷酸、肽类、脂质纳米颗粒、共价抑制剂和前体药物，对传统生物分析方法构成了挑战。鉴于这一现状，欧洲生物分析论坛（European Bioanalysis Forum，EBF）召集了一个跨行业工作组，系统性地识别并分类了七种模态类型所面临的生物分析挑战。反复出现的问题包括不稳定性、回收率低、基质效应以及抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）干扰。除记录这些挑战之外，该工作组还基于跨公司经验和科学讨论收集了初步的缓解策略。这些策略代表了潜在的方法路径，而非正式建议。研究结果强调，新兴模态需要早期跨职能评估和针对特定模态的分析策略，并以数据的预期用途为导向。这一初步分类为进一步的科学评估、业界共识和监管对话奠定了基础，支持随着对这些模态经验的积累，开发以科学为驱动、适合目的（fit-for-purpose）的生物分析方法。

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一、研究背景与研究目的

小分子生物分析领域常被视为一个相对成熟的学科，多数主要技术障碍已被克服。然而，随着药物研发的持续演进，寡核苷酸、肽类、前体药物、脂质纳米颗粒制剂、辅料、小分子生物标志物及共价抑制剂等新兴模态不断涌现，对传统基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的小分子分析策略提出了前所未有的挑战。这些模态具有复杂的理化性质、多样的生物相互作用及潜在的免疫原性，传统方法难以直接适用。在此背景下，欧洲生物分析论坛（EBF）组建了一个由二十余家成员公司代表组成的跨行业工作组，通过多次系统讨论，旨在识别并优先排序这些模态的主要分析障碍，分享不同公司和分析平台间的集体经验，并明确需要进一步行业共识和监管对话的领域。

二、研究内容与核心结论

该工作组系统性地识别出七类对生物分析科学家构成显著挑战的新兴小分子模态，包括寡核苷酸、肽类、制剂与脂质纳米颗粒、辅料、小分子生物标志物、共价药物和前体药物。每一类模态均涉及稳定性、选择性、灵敏度和定量方面的独特问题，这些问题可能影响生物分析方法的可靠性。工作组不仅记录了各类模态的典型挑战及其影响，还整理了跨公司正在考虑和评估的初步缓解策略。总体核心结论是：传统小分子生物分析方法无法自动适用于新兴模态的多样性；合适的分析策略需要早期考虑模态特异性特征、跨职能专业知识以及所得数据的预期用途。研究的关键不在于引入更广泛的验证，而在于生成正确的科学证据，以支持在相关使用情境（Context of Use，CoU）内做出可靠的决策。

三、关键技术与方法

本研究为欧洲生物分析论坛（EBF）发起的跨行业协作性综述研究，基于来自二十余家成员公司的代表所组成的专门工作组的多轮系统讨论。研究方法主要包括：对七类新兴小分子模态进行系统性分类与特征描述；收集并整理各公司在新药研发中遇到的典型生物分析障碍；汇总跨公司、跨分析平台的经验与初步缓解策略；结合现有监管指南（如ICH M10）及使用情境原则进行科学解读。研究不涉及具体的实验样本队列，而是基于行业集体经验的定性分析与归纳。

四、研究结果

1. 寡核苷酸（Oligonucleotides）

寡核苷酸涵盖反义寡核苷酸（ASOs）和小干扰RNA（siRNAs），可呈裸形式或与N-乙酰半乳糖胺、肽、脂质或抗体等偶联。其分子量通常为每链5–7 kDa，具有强负电荷、高极性和显著蛋白结合亲和力。研究发现的主要挑战包括：非特异性结合导致回收率变异；高分子量、多电荷态和阳离子加合物形成导致LC-MS检测灵敏度受限；反相色谱保留差需依赖离子对机制但缩短柱寿命；持续残留（carryover）污染后续样本；分析物、代谢物与内标间选择性区分困难；稳定同位素标记内标合成困难；杂交探针效率不足；抗药抗体（ADA）潜在干扰；以及组织分析需求。初步缓解策略包括使用低吸附聚丙烯管、在缓冲液中添加Tween或胍、在血浆中连续稀释制备标准曲线、优化离子对试剂、探索替代固定相、优化进样和冲洗程序、采用高分辨质谱（HRMS）、评估非同位素标记类似物、探索肽核酸（PNA）与锁核酸（LNA）探针化学、在方法开发阶段使用ADA阳性对照、以及标准化组织匀浆方案等。

2. 肽类（Peptides）

肽类涵盖大分子亲脂性肽、高阳离子肽、碱性肽、环肽及二硫键连接肽，分子量通常为1–6 kDa。研究发现的主要挑战包括：酶解不稳定性和高非特异性结合导致提取回收率低；稳定同位素标记内标合成困难；色谱保留过高或过低导致峰形差；阳离子加合物形成和多电荷态分布导致MS检测灵敏度低；环肽因高热力学稳定性导致非特异性碎裂和选择性困难；以及ADA潜在干扰。初步缓解策略包括在样本采集和处理中加入酶抑制剂、使用低吸附管和含表面活性剂缓冲液、评估非同位素标记结构类似物作为内标、测试极性嵌入或混合模式色谱柱、实施动态冲洗方案、优化离子源参数、探索环肽衍生化或部分开环方法，以及开展早期ADA风险评估。

3. 制剂与脂质纳米颗粒（Formulations and Lipid Nanoparticles）

此类模态涉及聚乙二醇化或包封于脂质纳米颗粒中的小分子药物。研究发现的主要挑战包括：高亲脂性导致色谱分离困难；从生物基质中分离分析物与其他脂质存在基质效应和选择性难题；以及需分别定量游离形式和总包封形式，且采样、储存和分析过程中复杂平衡可能被改变。初步缓解策略包括探索C8、苯基或氟化固定相等替代柱化学、超临界流体色谱、优化液-液萃取或双相固相萃取、使用稳定同位素标记内标、基质匹配校准、磷脂去除方案、高分辨质谱，以及为游离和总分析物分别定义并验证不同工作流程，严格控制处理条件以防止包封药物人为释放。

4. 辅料（Excipients）

辅料涵盖从低分子量化合物到高分子量聚合物的化学多样性物质。研究发现的主要挑战包括：参考物质的纯度和表征状态影响分析结果；合成副产物和内源性分子/代谢物干扰色谱分析；选择性不足需采用高分辨质谱；以及非特异性吸附和残留问题。初步缓解策略包括在方法开发前对辅料参考标准进行资质确认、必要时进行内部纯化或正交测试（如核磁共振NMR、体积排阻色谱SEC、质谱MS）、记录批间变异性、采用亲水相互作用色谱（HILIC）、混合模式或正交分离技术、多步提取或分级分离方法，以及将高分辨质谱作为辅料分析的默认策略。

5. 小分子生物标志物（Small Molecule Biomarkers）

小分子生物标志物包括脂质介质、类固醇和神经节苷脂等，分子量范围为300–2000 Da。研究发现的主要挑战包括：复杂代谢通路需同时定量多个暴露和灵敏度要求不同的分析物；不同分析物间相互转化导致不稳定性；高非特异性结合和残留影响可靠性；真实基质与替代基质中LC-MS响应不同导致平行性问题；同量异位生物标志物干扰准确性；以及参考标准表征不足。初步缓解策略包括开发多重LC-MS/MS方法、在采集点添加稳定剂、优化pH控制、使用低吸附实验器皿、积极针清洗和多溶剂梯度后运行、系统评估跨基质平行性、使用剥离基质或成分匹配的替代基质、采用高分辨质谱、衍生化策略或离子迁移谱正交分离，以及通过正交方法强化参考标准表征。

6. 共价药物（Covalent Drugs）

共价药物通常为分子量500–1000 Da的小分子，由“导向系统”和“弹头”组成，后者与靶标形成不可逆共价键。研究发现的主要挑战包括：生物基质中的稳定性具有物种特异性和基质特异性；共价结合物可不可逆地结合血细胞成分或血浆蛋白导致回收率问题；复杂代谢通路难以通过体外系统预测；以及靶点结合评估（target engagement）常被要求作为药效指标，需要复杂混合LC-MS方法和定制验证策略。初步缓解策略包括扩展血液细胞分配研究和基质比较实验、在采集管中预加稳定剂（如亲核清除剂或捕获剂）、快速冷却方案、平行测试抗凝剂和表面活性剂、早期整合跨组织和体内稳定性分析、评估离体或微采样方法，以及优化免疫捕获富集后LC-MS的混合方法和调整验证策略以适应非标准分析物形式和部分不可逆相互作用。

7. 前体药物（Prodrugs）

前体药物涵盖从小分子到与蛋白偶联的高分子量聚合物等多种类型。研究发现的主要挑战包括：设计用于体内转化的固有不确定性需在采集时添加稳定剂以确保准确定量；前体药物与活性药物理化性质差异大导致单次运行色谱分离困难；以及当前体药物在体内高度不稳定时灵敏度挑战尤为突出。初步缓解策略包括在采集管中预载特定稳定剂（如pH调节剂、酶抑制剂）、最小化冻存前时间、开发双分析物LC-MS/MS方法并优化色谱梯度和正交柱化学、必要时分别建立前体药物和活性药物方法并进行交叉验证、改进样本富集和浓缩技术、探索时间分辨稳定化步骤和快速在线萃取，以及尝试对不稳定部分进行衍生化以稳定后再分析。

五、讨论总结与研究结论

该研究的意义超越了单纯的技术障碍清单整理。新兴小分子模态的出现挑战了传统小分子生物分析方法可普遍适用的假设，肽类、寡核苷酸、共价抑制剂和复杂制剂日益挑战传统工作流程，可能需要整合LC-MS、配体结合和免疫原性策略。核心结论是：适当的生物分析策略必须由模态特征和数据预期用途驱动，并辅以早期跨职能协作，而非传统的孤立式方法。该工作组记录的初步缓解策略虽不构成EBF正式建议，但为进一步科学评估和共识提供了起点。EBF认为，这种结构化分享结合对现有生物分析指南（包括ICH M10）的科学驱动解读，以及科学验证和使用情境原则，可以支持适合目的的测定策略决策并为监管对话提供信息。该工作不是最终答案而是起点，旨在通过持续的竞争前协作，将初步发现转化为更详细的建议，最终支持可靠的药物开发决策，促进安全有效创新疗法的开发，惠及患者。