FSH超排母羊中褪黑素（MT）剂量方案对卵泡发育与卵母细胞发育能力的影响：氧化还原与分子响应

《Antioxidants》：Effects of Melatonin Dose Regimens on Follicular Development and Oocyte Developmental Competence in FSH-Superovulated Ewes: Redox and Molecular Responses

　　

氧化应激（oxidative stress）损害雌性哺乳动物的配子发育和胚胎能力。研究人员在FSH超排母羊体内卵母细胞采集过程中比较了四种褪黑素（MT）剂量方案（溶剂对照及每次注射20、40和80 mg）。40 mg方案显著降低卵泡闭锁并增加高质量卵母细胞和可移植囊胚。体内胚胎移植后的妊娠率和产羔率在40 mg组数值上更高，但未达到统计学显著性。40 mg方案观察到的有利反应在80 mg剂量下未维持。卵母细胞转录组学和卵泡液代谢组学揭示了与MT处理相关的多层次分子响应。在系统水平，40 mg MT与血清生殖激素变化相关，包括MT、E₂和IGF-1显著升高。在细胞和分子水平，MT处理与卵泡发育和卵母细胞质量变化相关，并伴氧化还原状态改变和能量代谢候选变化；MT1相关信号被鉴定为候选通路。MT处理与颗粒细胞中MT1和Ki-67表达增加、Bcl-2/Bax比值升高以及卵泡液ROS和MDA水平降低相关，表明氧化还原稳态和颗粒细胞增殖改善。MT处理与氧化还原状态改变相关，包括GSH显著增加和细胞内ROS降低，而ATP和线粒体超氧化物显示非显著变化。缺氧诱导因子1（HIF-1）信号和三羧酸（TCA）循环被鉴定为可能与卵泡能量-氧化还原重塑相关的候选通路。这些观察结果为进一步研究MT剂量方案以减轻母羊及其他物种中FSH超数排卵相关不利影响提供了基础。

研究背景与问题：哺乳动物卵泡储备和卵母细胞发育能力是雌性生殖功能的核心决定因素。氧化还原稳态破坏会引发持续损伤级联：活性氧（ROS）过量诱导卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡，破坏线粒体，损害三羧酸（TCA）循环和三磷酸腺苷（ATP）合成，并阻断卵母细胞胞质成熟。在采用卵泡刺激素（FSH）超数排卵和体外胚胎生产的大规模家畜生产中，外源促性腺激素易扰乱卵巢氧化还原平衡，导致广泛卵泡闭锁和卵母细胞产量降低。褪黑素（MT）由松果体合成，并可在卵巢组织局部自分泌，通过内分泌途径调节下丘脑-垂体-卵巢轴功能；卵泡液中可检测到高水平MT，其受体MT1和MT2表达于颗粒细胞和卵母细胞，使MT可直接靶向卵巢并协调氧化应激与凋亡。体外共培养研究证实，成熟培养基中外源MT可降低卵丘-卵母细胞复合体（COCs）中ROS积累，提高谷胱甘肽（GSH）储备，减轻氧化应激介导的配子损伤；小鼠和牛体内研究也显示MT减少闭锁卵泡、促进卵泡募集并改善囊胚发育。然而，短期体外MT处理不能复制活体完整内源内分泌网络或FSH超排诱导的长期生理变化，体外研究结果不能直接外推至体内绵羊育种；多数已发表体内研究使用啮齿类模型，其发情周期和激素通路与湖羊母羊不同，且多采用单一剂量而无梯度比较；多数研究聚焦单一氧化应激参数或体外胚胎表型，很少整合卵巢组织病理、颗粒细胞增殖/凋亡、内源激素动态、卵泡液微环境或卵母细胞细胞器功能进行多维验证；也少结合卵母细胞转录组学与卵泡液代谢组学进行分层机制解析；更缺乏胚胎移植后妊娠和产羔率等体内生殖结局数据。研究人员前期报道，小尾寒羊供体和受体应用MT缓释植入物可显著增加黄体数和回收胚胎数，并改善移植后妊娠和产羔率；在梅花鹿中，MT植入提高血清促性腺激素水平和黄体数，但胚胎数仅呈非显著上升趋势。但仅对供体母羊在卵泡期进行间歇皮下MT注射是否可获得类似生殖益处尚不清楚。基于这些空白，研究人员提出两个主要假设：不同MT剂量方案对母羊卵泡发育和卵母细胞发育能力的影响不同；MT处理伴随卵母细胞氧化还原稳态和线粒体功能变化。该研究并非旨在建立因果机制或确定最佳剂量，而是比较受试MT方案在卵巢、细胞、内分泌和分子等多水平的响应。

研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员以FSH同步超排成年湖羊母羊为体内模型，建立多剂量皮下MT给药系统，比较受试MT方案对卵巢发育和配子成熟的影响。研究整合组织形态、细胞增殖/凋亡、内分泌微环境、细胞器功能和生殖表型，并结合卵母细胞转录组学和卵泡代谢组学以鉴定核心调控分子。结果显示，40 mg MT方案显著减少卵泡闭锁，增加高质量卵母细胞和可移植囊胚；胚胎移植后妊娠率和产羔率在40 mg组数值上更高，但未达到统计学显著性；80 mg剂量未维持40 mg方案的有利反应。系统内分泌层面，40 mg MT与血清MT、雌二醇（E₂）和胰岛素样生长因子1（IGF-1）显著升高相关。细胞和分子层面，MT处理与卵泡发育和卵母细胞质量变化、氧化还原状态改变及能量代谢候选变化相关，MT1相关信号被鉴定为候选通路；颗粒细胞MT1和Ki-67表达增加，Bcl-2/Bax比值升高，卵泡液ROS和丙二醛（MDA）水平降低；卵母细胞GSH显著增加、细胞内ROS显著降低，ATP和线粒体超氧化物（mtO₂^?）呈非显著变化。HIF-1信号和TCA循环被鉴定为与卵泡能量-氧化还原重塑相关的候选通路。该研究的意义在于，为在母羊及其他物种中进一步研究MT剂量方案以减轻FSH超排相关不利影响提供基础，并为理解反刍动物卵巢内源抗氧化调控、卵母细胞线粒体代谢以及体外胚胎生产体系提供多维体内数据。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用FSH超排成年湖羊母羊，CIDR同期发情，皮下注射MT 0、20、40、80 mg/次，共六次，与FSH同步。样本队列：共231只湖羊母羊；梯度剂量试验96只随机四组；卵巢组织学和血清激素26只；卵母细胞线粒体荧光18只；胚胎移植供体16只、受体53只；转录组8只；卵泡液代谢组14只，质控后每组6只。关键技术包括：腹腔手术采集卵巢、卵泡、卵母细胞和卵泡液；卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和胚胎体外培养（IVC）；苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组化；ELISA和荧光法检测激素与氧化指标；荧光探针检测ROS、GSH、mtO₂^?和ATP；卵母细胞Smart-seq转录组及qRT-PCR技术确认；卵泡液非靶向LC-MS/MS代谢组；单胚胎移植；统计采用线性混合模型（LMM）、重复测量ANOVA和Fisher精确检验等。

研究结果：
3.1 褪黑素处理对母羊卵泡数量、卵母细胞回收和胚胎发育的影响：比较四组卵巢卵泡数和卵母细胞相关指数，40 mg MT组左、右及总卵巢卵泡数显著高于对照和20 mg组；回收卵母细胞数和可用卵母细胞数显著高于对照和20 mg组；卵母细胞回收率和可用卵母细胞率在四组间无显著差异。结论：40 mg MT增加卵泡数量和可用卵母细胞数。
3.2 褪黑素对卵母细胞体外发育能力的影响：比较四组IVF效率，40 mg MT组卵裂率和总囊胚率显著高于其他三组；40 mg组每个囊胚总细胞数较对照组显著升高；80 mg组囊胚细胞数也显著高于对照组，但40 mg与80 mg之间无显著差异；20 mg组与对照组无显著差异。结论：40 mg MT是受试方案中体外发育能力最有利的剂量，因此被选用于后续多维分析。
3.3 褪黑素处理对母羊卵巢形态、组织结构及卵泡群体的影响：测量卵巢形态参数，40 mg MT组卵巢长度、厚度、重量和体积显著大于对照组，宽度呈增加趋势但未达显著；H&E显示对照组皮质结构紊乱、闭锁卵泡多，40 mg组皮质完整有序，初级卵泡丰富且闭锁少；定量显示初级卵泡数增加、闭锁卵泡减少，原始和次级卵泡无显著组间差异。结论：40 mg MT维持卵巢皮质结构，增加初级卵泡并减少闭锁。
3.4 褪黑素处理对母羊关键功能蛋白表达的影响：
3.4.1 卵泡发生相关蛋白：免疫组化显示MT1、Ki-67和FSH-R主要表达于生长卵泡颗粒细胞层；40 mg MT组颗粒细胞MT1平均光密度显著升高，Ki-67阳性增殖颗粒细胞比例显著增加，FSH-R表达呈上升趋势但无统计学显著差异。结论：MT处理与MT1表达和颗粒细胞增殖增加相关。
3.4.2 颗粒细胞凋亡相关蛋白：Bcl-2和Bax主要定位于颗粒细胞；40 mg MT组Bcl-2平均光密度呈增加趋势但无显著差异，Bax显著下调，Bcl-2/Bax比值显著升高。结论：40 mg MT与颗粒细胞抗凋亡倾向增强相关。
3.5 褪黑素处理对卵母细胞线粒体功能和氧化还原稳态的影响：采用荧光探针检测ATP、GSH、mtO₂^?和总ROS，40 mg MT组卵母细胞内GSH水平显著升高，ROS水平显著降低；ATP水平呈非显著升高，MitoSOX水平呈非显著降低。结论：MT处理与卵母细胞抗氧化能力增强相关，而ATP和线粒体超氧化物变化未达统计显著。
3.6 褪黑素补充对血清激素谱的影响：从第0天及第9至12天采血，二因素重复测量ANOVA显示MT、E₂和IGF-1存在显著处理效应，FSH、促黄体生成素（LH）、孕酮（P₄）、生长激素（GH）、催乳素（PRL）和抗苗勒管激素（AMH）无显著处理效应；MT、IGF-1、P₄、GH和PRL存在显著时间效应；P₄和PRL存在显著处理×时间交互，但各时间点经?idák校正后两组间无显著差异。40 mg MT组第10天和第11天循环MT水平显著更高，E₂和IGF-1分别在第11天和第10天显著升高；FSH、LH和GH呈上升趋势但各时间点未达显著；AMH全期无显著组间差异。结论：40 mg MT与血清MT、E₂和IGF-1升高相关，并可能改变P₄和PRL的时间动态。
3.7 褪黑素干预对卵泡液生理生化指标的影响：检测卵泡液激素、生长因子和氧化应激标志物，40 mg MT组卵泡液MT、IGF-1和总抗氧化能力（T-AOC）显著升高，ROS和MDA含量显著降低；E₂、P₄和GSH浓度无显著组间差异。结论：MT处理与卵泡液抗氧化环境和IGF-1水平改善相关。
3.8 褪黑素处理对体外囊胚移植后体内发育结局的影响：将IVM/IVF/IVC来源囊胚移植至同期受体母羊，40 mg MT组妊娠率为55.6%（15/27），对照组为46.2%（12/26），相对风险（RR）为1.20（95% CI：0.70–2.06），差异无统计学显著性；在妊娠受体中，40 mg组产羔成功率为93.3%（14/15），对照组为83.3%（10/12），RR为1.12（95% CI：0.84–1.49），差异无统计学显著性。结论：40 mg MT组妊娠和产羔率数值上较高，但未达统计显著。
3.9 褪黑素对绵羊卵母细胞转录组及qRT-PCR技术确认的影响：主成分分析显示对照组和40 mg MT组明显分离且组内重复聚类良好；共鉴定903个差异表达基因（DEGs），其中417个上调、486个下调；GO和KEGG富集显示DEGs主要富集于生物过程调控、信号转导、免疫应答、细胞黏附和发育通路，并显著富集于钙信号、ErbB、HIF-1和趋化因子通路；基于76个DEGs构建蛋白-蛋白互作（PPI）网络，FN1、PLG和PRKCA为核心节点，NFKB1等高连接枢纽基因被筛选；从枢纽基因中选择11个候选关键基因，并因MTNR1A为编码褪黑素受体的DEG而纳入，共12个基因进行qRT-PCR技术确认，其表达趋势与RNA-seq数据一致。结论：MT处理与卵母细胞多通路分子响应相关，MTNR1A等为候选分子。
3.10 褪黑素对卵泡液代谢组的影响：主成分分析显示对照组和40 mg MT组明显分离且组内聚类紧密；共鉴定361个差异代谢物，其中75个上调、286个下调；KEGG富集显示差异代谢物显著富集于卵巢类固醇生成、TCA循环、氨基酸代谢、孕酮介导的卵母细胞成熟和卵母细胞减数分裂等通路。转录组和代谢组样本来自独立母羊队列，无匹配个体样本，因此仅进行群体水平趋势比较，未进行精确多组学关联分析。结论：MT处理与卵泡液代谢谱改变及能量-类固醇代谢候选通路相关。

讨论总结：研究人员在讨论中指出，该研究建立了FSH同步超排成年湖羊并梯度皮下MT给药的体内模型，系统比较了四种MT剂量方案。40 mg MT显著改善卵泡数量、卵母细胞体外发育能力和囊胚质量，而80 mg未维持这些有利反应。研究人员提出该剂量依赖反应模式可能与MT1/MT2受体平衡假说一致，但该解释为基于表型差异和既往文献的事后机制假设，并未在本研究中直接测试；也不能排除非特异性自由基清除或其他脱靶效应。组织学和免疫组化结果提示，40 mg MT维持卵巢皮质结构，上调颗粒细胞增殖标志Ki-67，提高Bcl-2/Bax比值，减少闭锁卵泡，而原始卵泡无组间差异；MT1在颗粒细胞层高表达，提示循环MT可能直接靶向颗粒细胞膜受体，但由于未进行受体阻断或基因干扰，不能建立MT1的因果作用。线粒体功能和氧化还原结果显示，40 mg MT组卵母细胞GSH显著增加、ROS显著降低，ATP和mtO₂^?呈非显著变化；研究人员讨论认为，体内持续MT富集可能与卵母细胞氧化磷酸化效率变化相关，但ATP未达统计显著。转录组和代谢组提示钙信号、ErbB、HIF-1、TCA循环和卵巢类固醇生成等候选通路，但由于两个组学平台样本未配对，只能反映群体水平趋势，需配对多组学试验进一步确认因果关系。血清和卵泡液结果显示，40 mg MT组血清MT、E₂和IGF-1显著升高，卵泡液MT、IGF-1和T-AOC同步升高，卵泡液ROS和MDA降低；研究人员讨论中提出MT可能通过MT1依赖机制增强IGF-1信号效率，但相关机制未在本研究中直接验证。胚胎移植后妊娠和产羔率在40 mg组数值上较高但未达统计显著，研究人员认为这可能与仅处理供体卵泡期、受体未处理、样本量有限以及母羊内源激素稳态补偿有关；该结果与前期小尾寒羊供体和受体同时应用MT植入物显著改善妊娠和产羔的结果不完全一致。研究局限包括：MT1介导的调控级联仅基于体内表型和已发表细胞文献推断，需受体拮抗剂和siRNA敲低验证；卵母细胞转录组和卵泡液代谢组来自独立队列，无匹配单样本；胚胎移植受体数量有限，且未保留供体-胚胎-受体个体映射，可能影响生殖结局解释；80 mg有利反应下降的具体机制尚未通过卵泡脂质代谢或卵母细胞线粒体膜电位检测阐明。总体而言，该研究提供了反刍动物特异性梯度体内多维评价框架，为卵巢氧化损伤、卵母细胞线粒体代谢和肉羊体外胚胎生产体系研究提供系统体内实验支持。

研究结论翻译：从绵羊育种中标准化FSH超排和活体采卵的角度，在超排母羊中，40 mg MT方案与FSH同时皮下给药与卵巢氧化还原状态改变、卵泡闭锁减少以及高质量配子和可移植囊胚产量升高相关。体内胚胎移植后的妊娠率和产羔率数值上更高，但未达到统计学显著性。40 mg方案观察到的有利反应在80 mg剂量下未维持。据研究人员所知，这是首个在母羊中比较多种MT剂量方案的研究。在系统内分泌水平，40 mg MT方案与血清MT、E₂和IGF-1显著升高相关。在细胞和分子水平，MT处理与绵羊卵泡发生和卵母细胞质量改变相关，MT1相关信号被鉴定为候选通路，并伴氧化还原状态改变和能量代谢候选变化。整合组学分析鉴定HIF-1信号和TCA循环为与卵泡能量-氧化还原重塑相关的候选通路。然而，该研究并非旨在建立因果机制或确定最佳剂量，所提出的通路仍为候选，需要功能验证。