无辅料 Porphyra/Pyropia sp. 来源多核苷酸（PS-PDRN）调节 LPS 刺激巨噬细胞与小鼠急性肺损伤中的硝化应激

《Marine Drugs》：An Excipient-Free Porphyra/Pyropia sp.-Derived Polynucleotide Modulates Nitrative Stress in LPS-Stimulated Macrophages and Murine Acute Lung Injury

　　

多聚脱氧核糖核苷酸（polydeoxyribonucleotide, PDRN）是一种传统上来源于鲑鱼的 DNA 衍生材料，这促使研究人员关注可规模化的非动物替代来源。在本研究中，研究人员表征了一种从栽培 Porphyra/Pyropia sp. 中纯化的无辅料多核苷酸（PS-PDRN），并检测其自由基清除特性及其对硝化应激相关读数的影响。三种 Bangiales 物种的参考核基因组组装均富含 GC（65.08–71.26%），而传统 PDRN 来源物种 Oncorhynchus keta 为 43.89%，这为该材料的藻类来源提供了基因组背景。PS-PDRN 显示可忽略的 DPPH 自由基清除，但呈剂量依赖性 ABTS 自由基阳离子清除，这一特征与鲑鱼来源 PDRN 相同，而不同于纯化前中间体。在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激的 RAW 264.7 巨噬细胞中，50 μg/mL PS-PDRN 使亚硝酸盐（NO₂^?）升至 LPS 组的 133%，硝酸盐（NO₃^?）降至 85%，提高 NO₂^?/NO₃^? 分配比，并使 3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine）降至 77%，同时诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）蛋白（119%）和总 S-亚硝基硫醇（S-nitrosothiol）池（97%）维持，NADPH 氧化酶（NADPH oxidase）活性不变。在小鼠 LPS 诱导急性肺损伤（acute lung injury, ALI）中，PS-PDRN 使肺 3-硝基酪氨酸降至 LPS 组的 53%，而肺 iNOS 蛋白保持 95%，Nos2 为 67%，Hmox1 升至 148%，总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性超过 LPS 水平。这些初步发现表明，纯化的 Porphyra/Pyropia sp. 来源多核苷酸具有不同于其纯化前材料的自由基清除谱，并降低蛋白硝化，而不成比例抑制 iNOS 相关读数。这些结果支持进一步评估栽培 Porphyra/Pyropia sp. 作为 PDRN 类多核苷酸的非动物来源，并为机制、制造和转化验证提供基础。

论文主体解读

研究背景：急性肺损伤（acute lung injury, ALI）及其重症急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）死亡率高，药物治疗选择有限。LPS 驱动肺泡巨噬细胞活化后，诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS/NOS2）与 NADPH 氧化酶 2（NADPH oxidase 2, NOX2/CYBB）共诱导，一氧化氮（NO）与超氧化物生成过氧亚硝酸盐，硝化蛋白酪氨酸残基并造成组织损伤。传统上 iNOS 被视为抑制靶点，但在皮肤创伤修复、内毒素耐受、自身免疫炎症和炎症性肠病中，iNOS 表达仍高而炎症输出下降，遗传或药理缺失 iNOS 反而加重结局。多聚脱氧核糖核苷酸（polydeoxyribonucleotide, PDRN）作为腺苷 A_2A 受体（adenosine A_2A receptor, A_2A）激动剂用于组织修复，也显示 iNOS 和 NO 代谢物升高而 TNF-α、IL-1β、IL-6 下降。因此，iNOS 诱导的后果可能取决于 NO 产生所处的氧化还原环境，NADPH 氧化酶来源氧化剂输入是主要决定因素。PDRN 目前主要来自鲑鱼，栽培 Pyropia 红藻因规模养殖、食用历史和可回收核酸而具有吸引力。但既往 Pyropia 制剂含绿茶提取物和生育酚，抗氧化共组分干扰对多核苷酸本身的归因；巨噬细胞研究仅测亚硝酸盐，NO 在亚硝酸盐、硝酸盐、S-亚硝基硫醇和蛋白硝化之间的分配未解决。为此，研究人员表征无辅料 Porphyra/Pyropia sp. 来源多核苷酸（PS-PDRN），比较其自由基清除谱，并在 LPS 刺激巨噬细胞和小鼠 ALI 中检查 NO 输出、蛋白硝化、NADPH 氧化酶和抗氧化反应基因。

研究人员开展基因组背景、体外和体内研究，得出 PS-PDRN 选择性清除 ABTS 而非 DPPH，与鲑鱼来源 PDRN 相似，不同于纯化前中间体；在巨噬细胞中提高 NO₂^?、降低 NO₃^? 和 3-硝基酪氨酸，同时维持 iNOS 蛋白与总 S-亚硝基硫醇池；在小鼠 ALI 中降低肺 3-硝基酪氨酸，而 iNOS 蛋白和 Nos2 未成比例下降，并诱导 Hmox1 和 SOD。其意义在于提示纯化藻源多核苷酸可降低蛋白硝化而不成比例抑制 iNOS 相关读数，支持其作为非动物 PDRN 类材料进一步开展机制、制造和转化验证。

关键方法概括：PS-PDRN 及纯化前中间体由 All In One GENETECH Ltd. 提供，原料为韩国 Wando 栽培 Porphyra/Pyropia sp.；商业鲑鱼来源 PDRN 购自 MedChemExpress；RAW 264.7 巨噬细胞购自 ATCC；BALB/c 小鼠购自 Raon Bio。技术包括琼脂糖凝胶电泳、紫外与成分表征、DPPH/ABTS 自由基清除检测、LPS 刺激 RAW 264.7 共处理及 NO 代谢物/3-硝基酪氨酸/S-亚硝基硫醇/iNOS/NADPH 氧化酶/基因表达检测、鼻内 LPS 诱导小鼠 ALI 并分析肺和 BALF、qRT-PCR、结构化 PubMed 调查及统计。

结果部分：
2.1 Physical Characterization and Source-Genome Context of PS-PDRN（PS-PDRN 的物理表征与来源基因组背景）：通过 1.5% 琼脂糖凝胶电泳，PS-PDRN 呈单一条带并位于最小 25 bp 标志带之前，说明为低分子量制备物。三种 Bangiales 参考核组装 GC 含量为 65.08–71.26%，而 Oncorhynchus keta 为 43.89%。纯化显著降低非核酸成分，总多酚从纯化前中间体的 21.7 mg GAE/g 干重降至 1.0 ± 0.073 mg GAE/g 干重；A260/A280 为 1.93 ± 0.06，A260/A230 为 1.91 ± 0.04；残留蛋白和多糖分别为 DNA 含量的 0.60 ± 0.11% 和 1.83 ± 0.14%，内毒素低于 0.1 EU/mg。

2.2 PS-PDRN Scavenges ABTS but Not DPPH Radicals（PS-PDRN 清除 ABTS 而不清除 DPPH 自由基）：DPPH 与 ABTS 检测结果差异明显。丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene, BHT）对两种自由基均呈浓度依赖性清除；纯化前中间体也清除两者；PS-PDRN 在 250 μg/mL 对 DPPH 清除不超过 4%，但清除 37.2% ABTS，鲑鱼来源 PDRN 几乎相同。将两种检测相互作图，两种纯化多核苷酸位于高 ABTS、低 DPPH 区域，而 BHT 和纯化前中间体接近等活性线，提示纯化去除了具有氢原子转移能力的成分。

2.3 PS-PDRN Raises the Nitrite Fraction of NO Output and Lowers Nitration While iNOS Protein Is Maintained（PS-PDRN 提高 NO 输出中亚硝酸盐比例并降低硝化，同时维持 iNOS 蛋白）：在 LPS 刺激 RAW 264.7 巨噬细胞中，功能实验所用条件细胞活力均高于相应对照的 80%。50 μg/mL PS-PDRN 使 NO₂^? 升至 LPS 组的 133%，NO₃^? 降至 85%，NO₂^?/NO₃^? 比从 1.55 升至 2.44，总 NO 代谢物为 LPS 组的 114%。3-硝基酪氨酸降至 77%，NADP⁺/NADPH 比向对照水平降低，NADPH 氧化酶活性为 LPS 组的 88% 且与 LPS 无显著差异；iNOS 蛋白为 119%，Nos2 为 116%，Nqo1 为 113%，总 S-亚硝基硫醇为 97%。APX-115 和 1400W 同时降低 NO₂^? 与 NO₃^?。结论是 PS-PDRN 更像改变 NO 衍生产物分配，而非减少 NO 生成。

2.4 The Observed Pattern Recurs Across the iNOS Literature（观察到的模式在 iNOS 文献中重现）：结构化调查检索同时报告 NOS/NO 状态与炎症、硝化或结局指标的原发研究。在遗传功能缺失、药理抑制和适应状态研究中，高 iNOS 条件均与炎症输出降低及组织结局改善或不变相关，三项 PDRN 特异性报告方向相同。唯一相反的 Pyropia 来源制剂报告在纯度、处理方案和 NO 读数方面不同。该调查为描述性而非系统综述。

2.5 PS-PDRN Lowers Lung 3-Nitrotyrosine Relative to Total NO Metabolite Output（PS-PDRN 相对总 NO 代谢物输出降低肺 3-硝基酪氨酸）：LPS 诱导 ALI 后体温和肺湿/干比升高，地塞米松和 PS-PDRN 均可减轻。肺 NO₂^? 和 NO₃^? 均升高，NO₂^?/NO₃^? 比从 4.38 降至 1.13，PS-PDRN 部分恢复至 2.29，地塞米松为 2.99；PS-PDRN 组总肺 NO 代谢物为 LPS 组的 61%，地塞米松为 35%；BALF 总 NO 代谢物在 PS-PDRN 组为 LPS 组的 102%。肺 3-硝基酪氨酸在 LPS 后升高 3.6 倍，PS-PDRN 降至 53%，地塞米松降至 66%；按总肺 NO 代谢物单位计，PS-PDRN 为 LPS 的 0.87 倍，地塞米松为 1.89 倍。转录水平上，地塞米松使 Nos2 降至 44%，PS-PDRN 为 67%；Cybb 分别降至 70% 和 67%；Hmox1 被 LPS 诱导 3.1 倍，PS-PDRN 进一步升至 148%，地塞米松降至 42%；Nqo1 分别为 114% 和 88%。蛋白水平上，肺 iNOS 在 LPS 后升高 3.0 倍，地塞米松降至 48%，PS-PDRN 为 95%。MPO 活性分别降至 LPS 的 29% 和 57%；总 SOD 活性在 LPS 后为 1.5 倍，PS-PDRN 为 1.9 倍，地塞米松为 1.6 倍。将 3-硝基酪氨酸对 Nos2 作图，地塞米松位于比例参考线上方，PS-PDRN 位于下方。Hmox1 是 PS-PDRN 超过 LPS 组的唯一选定终点。

讨论部分：
3.1 Relation to Earlier Porphyra/Pyropia-Derived Preparations：既往 Kim et al. 和 Lee et al. 研究使用含绿茶提取物和生育酚的提取制剂，而本研究的 PS-PDRN 在纯化产物阶段无辅料并量化残留多酚；既往以亚硝酸盐、细胞因子和 MAPK 信号表征炎症，本研究将 NO 解析为 NO₂^?、NO₃^?、S-亚硝基硫醇和蛋白硝化，并测 iNOS 蛋白、NADPH 氧化酶活性和 Nrf2 靶基因。既往巨噬细胞研究用 12 h 预处理，本研究体外用共处理。研究在炎症方向一致，但 NO 输出不同；亚硝酸盐减少可与 NO 合成减少或 NO 命运重分配相容，单独测亚硝酸盐不能区分。

3.2 Preparation Purity Determines the Scavenging Phenotype：纯化前中间体在 250 μg/mL 清除 DPPH 达 41%，而 PS-PDRN 不超过 4%，说明纯化去除了可进行氢原子转移的非多核苷酸共提取成分，而非富集广谱抗氧化剂。细胞和肺中蛋白硝化降低发生于常规抗氧化能力弱的材料，更可能归因于多核苷酸的生物学作用。ABTS 与 DPPH 差异可能与反应机制、溶剂可及性及多核苷酸在醇性 DPPH 体系中溶解度有限有关，但未直接测试。鲑鱼来源 PDRN 处于相近位置，提示这是纯化多核苷酸制备物的一般特征。

3.3 Treatment Schedule Differs Between Systems：体外用共处理，既往报告用 12 h 预处理，动物实验用 5 天口服预处理。A_2A 受体为 Gs 偶联，常经腺苷酸环化酶–cAMP–PKA 轴调节 MAPK，处理时机可能影响受体近端信号先于或伴随 LPS 诱导的转录启动。两系统 NO 输出不同，但硝化方向一致下降。既往相关制剂报告 LPS 后 10–15 min ERK 和 p38 磷酸化降低，而亚硝酸盐在 24 h 测定，故 MAPK 抑制与亚硝酸盐变化的因果关系未确立。

3.4 Two Interpretations of the Observed Profile：一种解释为 PS-PDRN 主要抗炎，硝化标记降低源于炎症信号减弱；另一种为 PS-PDRN 作用于 iNOS 来源 NO 的氧化还原分配环境，降低向硝化分流。现有数据不能定论。支持后者的观察包括：Nos2 为 LPS 组 67%、肺 iNOS 蛋白 95%，而 3-硝基酪氨酸降至 53%；地塞米松呈相反模式。按总 NO 代谢物单位计，PS-PDRN 的 3-硝基酪氨酸为 0.87 倍，地塞米松为 1.89 倍；巨噬细胞中 3-硝基酪氨酸降至 77% 而总 NO 代谢物为 114%。总 NO 代谢物整合合成，不解析局部酶活、NOS 解偶联或 MPO 依赖硝化。

3.5 Relation to A_2A Signalling and to the Redox-Buffered Model：鲑鱼来源 PDRN 为 A_2A 激动剂，A_2A 激活可减少关节炎和脊髓损伤模型细胞因子；睾丸缺血–再灌注中 DMPX 可取消 PDRN 保护。PS-PDRN 为同类多核苷酸且清除谱相似，A_2A 参与可能，但未测受体依赖。PS-PDRN 为短 DNA 片段，内体 Toll 样受体 9（Toll-like receptor 9, TLR9）也是候选输入；TLR9 经 NF-κB 信号可解释 iNOS 维持和无 LPS 时低水平亚硝酸盐产生。该模式与氧化还原缓冲的 iNOS 来源 NO 信号模型一致：当超氧竞争受限时，持续 NO 产生可与受限炎症输出相容。S-亚硝基硫醇池在 PS-PDRN 下维持而硝化下降，支持 S-亚硝基化与硝化之间的分配。框架预测炎症小体启动减弱，但未测。

3.6 Material Differentiation and Translational Relevance：来源基因组背景与将 Porphyra/Pyropia sp. 用作非动物 PDRN 来源相关。P. yezoensis 与 O. keta 参考核基因组 GC 组成差异大，但纯化藻源和鲑鱼源多核苷酸在 DPPH/ABTS 检测平面接近。栽培海洋生物质、无辅料纯化、低分子量片段谱及与鲑鱼 PDRN 的功能可比性支持 PS-PDRN 作为 PDRN 类材料平台候选。供应韧性、成本、可持续性和法规标准化仍为转化假说，需规模放大、技术经济、生命周期和批次研究。

3.7 Limitations：未药理测试受体依赖；MPO 活性降低程度与 3-硝基酪氨酸降低相当，且 3-硝基酪氨酸非过氧亚硝酸盐专属足迹，故未分离过氧亚硝酸盐与 MPO 依赖硝化；S-亚硝基硫醇仅测总量，未鉴定靶蛋白；iNOS 蛋白用免疫分析而非免疫印迹，未解析二聚化或修饰蛋白；未直接测 NOS 催化活性，总 NO 代谢物为整合指数；总 SOD 未区分异构体；Nrf2 参与由靶基因表达和 SOD 活性推断，未测核转位和 DNA 结合；50 μg/mL 时 WST-8 信号相对 LPS 降低约 16%，可能间接影响；仅单时间点；体内单剂量；抗氧化基因仅在 LPS 攻击后终点测，不能区分预处理期诱导或攻击反应；急性 LPS 模型外推慢性气道炎症需验证，慢性模型正在进行。

3.8 Directions for Extension：优先验证正在进行的慢性气道炎症模型；药理测试 A_2A 受体依赖；用 BH₄/BH₂ 定量确认 NOS 偶联状态；区分过氧亚硝酸盐依赖与 MPO 依赖硝化；检查预处理与共处理方案的时间依赖性；氧化蛋白产物对肺 NOS 活性的调节也是候选路径。

结论翻译：一种从栽培 Porphyra/Pyropia sp. 纯化的无辅料多核苷酸在制造、电泳、自由基清除、细胞和体内水平得到定义。PS-PDRN 与鲑鱼来源 PDRN 共享 ABTS 优于 DPPH 的选择性清除谱，尽管 P. yezoensis 和 O. keta 参考基因组 GC 组成显著不同。在炎症模型中，该材料相对总 NO 代谢物输出降低蛋白硝化，同时维持 iNOS 蛋白，并在巨噬细胞中诱导抗氧化反应标志物而不直接抑制 NADPH 氧化酶。综上，这些观察将 PS-PDRN 表征为工艺定义的低分子量非动物 PDRN 类海洋材料，并为受体依赖、NOS 偶联、慢性疾病、规模放大和工业标准化研究提供理由。