瓜籽蛋白的高值化利用：酶解工艺优化与水解产物功能特性解析

《CyTA - Journal of Food》：Unlocking the potential of melon seed protein: enzymatic hydrolysis and functional characterization of protein hydrolysates

　　

瓜籽是富含蛋白质但长期未被充分利用的副产物。本研究以六种蛋白酶（木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶）对瓜籽蛋白进行酶解，制备蛋白水解物并评价其功能特性。水解物的抗氧化活性及α-淀粉酶（α-amylase）抑制活性被系统评估。结果显示，中性蛋白酶水解物表现出最强的DPPH自由基清除活性，其IC50值低至0.72 ± 0.03 mg·mL?1；木瓜蛋白酶水解物则展现出最强的羟基自由基清除活性，IC50值为5.08 ± 0.36 mg·mL?1；胰蛋白酶水解物具有最强的α-淀粉酶抑制活性，IC50值仅为0.50 ± 0.04 mg·mL?1。筛选出的水解物表现出良好的pH和热稳定性，且其持油性（oil-holding capacity）优于持水性（water-holding capacity）。超滤结果表明，分子量小于3 kDa的组分生物活性显著增强。上述发现凸显了酶解技术在将瓜籽蛋白转化为功能性蛋白水解物方面的潜力，为植物源蛋白资源的高值化利用提供了有力支撑。

一、研究背景与目的

瓜类（Cucumis melo L.）是全球广泛种植的园艺作物，甜瓜和哈密瓜为其典型品种。联合国粮农组织（FAO）报告显示，自2021年以来全球瓜类（不含西瓜）年产量稳定在约2800万吨。瓜类可食用部分主要为果肉，常被加工成果脆、果汁、果酱、果酒和果醋等增值产品。然而，约占果实总重量10%的瓜籽常作为副产物被丢弃，年丢弃量估计达280万吨，造成显著资源浪费和环境压力。尽管瓜籽富含蛋白质、油脂和维生素等营养成分，其加工技术和工业应用仍不成熟，限制了其在食品加工产业中的潜在价值。

生物活性肽按原料来源可分为植物源、动物源、海洋源、微生物源和生物合成肽，通常由2–20个氨基酸残基组成，分子量一般低于6000 Da，具有抗氧化、抗炎、降压和免疫调节等多种生物功能。释放天然蛋白中生物活性肽的主要途径包括微生物发酵、化学水解和酶解。微生物发酵虽适合大规模生产且成本较低，但周期长、对环境敏感，需严格控制工艺；化学水解操作简单成本低，但反应过程难以精确控制，易导致肽结构和功能改变；酶解则利用特异性酶在温和条件下分解蛋白质，具有反应参数可控、效率高、节能环保且能有效保留天然生物活性等优势，已成为制备植物源降糖肽的首选方法。

鉴于瓜籽的营养价值及其利用不足的现状，回收并功能化利用瓜籽蛋白是提升该加工副产物价值的重要途径。此前研究已初步探索瓜籽蛋白水解物的酶法制备，如Botutihe等人报道热溶素水解物的抗氧化和胆固醇相关活性优于胃蛋白酶和胰蛋白酶水解物，但更广泛蛋白酶种类对瓜籽蛋白水解物功能及生物学特性的影响仍缺乏系统比较。因此，本研究选用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶六种蛋白酶制备瓜籽蛋白水解物，全面评价其抗氧化活性、α-淀粉酶抑制活性、持水持油功能特性及pH和热稳定性，并通过超滤膜分级探究活性分布，为瓜籽源肽的功能理解及其在食品体系中的应用奠定基础，同时促进农业加工副产物的可持续增值利用。

二、主要关键技术方法

研究人员从亳州药都农商行收集瓜籽，经粉碎过筛、正己烷脱脂、碱溶酸沉法提取瓜籽蛋白（蛋白含量约69.79%±0.89%）。采用六种蛋白酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶）在各自最适温度和pH条件下，以酶与底物比8000 U·g^?1蛋白、底物浓度4%（w/v）进行4小时酶解，沸水浴灭活后离心取上清冻干。通过三氯乙酸（TCA）可溶性蛋白法测定水解度（DH），采用DPPH自由基清除、羟基自由基清除和α-淀粉酶抑制三种体外活性评价体系，结合pH（2–10）和温度（20–100°C）稳定性考察，测定持水性（WHC）和持油性（OHC），最后使用10 kDa和3 kDa截留分子量超滤膜对水解物进行分级，比较不同分子量区段（>10 kDa、3–10 kDa、<3 kDa）的生物活性。

三、研究结果

不同蛋白酶水解瓜籽蛋白的水解度：中性蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶的水解度显著高于其他酶，分别达40.80%±1.54%、38.80%±1.00%和35.70%±0.76%；木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分别为26.70%±0.89%和25.30%±0.93%，两者无显著差异；碱性蛋白酶最低，为18.60%±0.64%。水解效率差异反映蛋白水解程度不同，但不必然对应水解物抗氧化和酶抑制活性的差异。

瓜籽蛋白水解物的DPPH自由基清除活性及其稳定性：六种蛋白酶水解物均表现出可检测的DPPH自由基清除活性，中性蛋白酶、菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶水解物显著高于未水解蛋白。IC₅₀值排序为中性蛋白酶< />< />< />₅₀为0.72±0.03 mg·mL^?1。中性蛋白酶底物特异性广，可高效水解蛋白为小肽片段，含芳香族和疏水氨基酸的肽因共振稳定作用可能增强自由基清除能力。pH和热稳定性研究表明，40–100°C范围内清除活性随温度升高显著下降（从47.74%±0.05%降至2.58%±0.30%），可能与热诱导的芳香族氨基酸残基改变及肽聚集有关；pH 6–8时活性逐渐升高，pH 8–10碱性条件下急剧下降（从59.51%±1.04%降至33.53%±0.54%），可能与肽溶解性和构象变化及氨基酸残基化学修饰有关。

瓜籽蛋白水解物的羟基自由基清除活性及其稳定性：六种酶水解物均比天然蛋白表现出更高的羟基自由基清除活性，酶解可暴露额外氨基酸残基（如Trp、Tyr、His、Cys），增加供氢能力。IC₅₀排序为木瓜蛋白酶< />< />< />< />< />₅₀为5.08±0.36 mg·mL^?1。木瓜蛋白酶底物特异性广，优先切割疏水氨基酸（Val、Leu、Ile、Ala、Phe）相邻肽键，产生较高比例低分子量肽（≤1000 Da）。pH 2–8范围内清除活性稳定在约40%，pH 10时升至53.04%±0.009%，碱性条件改善氨基酸残基电离状态从而增强供氢能力；20–100°C温度范围内活性稳定维持在约44%，表现出良好热稳定性。

瓜籽蛋白水解物的α-淀粉酶抑制活性及其稳定性：六种蛋白酶水解均显著增强α-淀粉酶抑制活性，IC₅₀排序为胰蛋白酶< />< />< />< />< />₅₀为0.50±0.04 mg·mL^?1。胰蛋白酶优先切割赖氨酸和精氨酸C端肽键，产生的肽可能与α-淀粉酶催化区域形成有利相互作用。pH和温度对抑制活性影响不显著，pH 8时活性最高（69.64%±0.65%），100°C时达71.20%±0.17%，其他处理条件下降低幅度均低于15%，表明胰蛋白酶水解物在加工相关条件下可保持抑制功能。

瓜籽蛋白水解物的持水性和持油性：酶解后瓜籽蛋白的持水性下降，因蛋白降解为小肽和游离氨基酸后水结合位点减少。胰蛋白酶水解物持水性最低（0.04±0.04 g·g^?1），但持油性最高（3.39±0.15 g·g^?1），酶解暴露疏水区域促进肽与脂质分子相互作用。

超滤分级与功能活性：<3 kDa组分普遍表现出更高生物活性。5 mg·mL^?1浓度下，中性蛋白酶水解物<3 kDa组分的DPPH清除活性最高（96.80%±1.33%），木瓜蛋白酶对应组分羟基自由基清除活性最强（92.32%±1.46%），两者均与同浓度维生素C（Vc）相当；胰蛋白酶水解物<3 kDa组分的α-淀粉酶抑制活性达95.50%±0.63%，高于同条件下阿卡波糖（69.85%±1.68%）。低分子量肽因结构破坏释放后具有更大构象灵活性、更好可及性及富集的疏水/芳香族氨基酸残基，从而增强自由基清除和酶抑制能力。

四、讨论与结论

本研究通过六种蛋白酶酶解瓜籽蛋白成功制备了富含生物活性肽的水解物。中性蛋白酶水解物DPPH自由基清除活性最强但对pH和温度相对敏感；木瓜蛋白酶水解物羟基自由基清除活性最强，具良好热稳定性且在pH 10碱性条件下活性增强；胰蛋白酶水解物α-淀粉酶抑制活性最高，持油性优异，且在不同pH和温度条件下稳定性良好。超滤分析表明<3 kDa组分活性最高：5 mg·mL^?1时，中性蛋白酶来源<3 kDa组分DPPH清除活性为96.8%±1.33%，木瓜蛋白酶来源组分羟基自由基清除活性为92.32%±1.46%，胰蛋白酶来源组分α-淀粉酶抑制活性为95.5%±0.63%。低分子量肽特别是胰蛋白酶水解产生的肽兼具抗氧化和消化酶抑制等多功能性，展示了体外功能潜力，为功能性食品应用提供了研究基础。

研究局限性包括：功能特性评价仅限于持水性和持油性，未考察溶解性、乳化活性和起泡性等食品相关性质；超滤虽富集了低分子量肽组分，但未进行详细肽鉴定和结构表征，其生物活性分子机制尚不明确。未来研究应聚焦<3 kDa肽的全面序列鉴定，结合计算机辅助筛选与实验验证阐明构效关系，并进一步探索其应用潜力。该研究受中国大学生创新创业训练计划项目资助（项目编号2026137140011和2025137140010），所有作者声明无利益冲突。